毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选菌体的准备： 1. 挑取酵母单菌落，接种至含有 5ml YPD 培养基的 50ml 三角瓶中，30 ℃、250-300r/min培养过夜； 2. 取 100-500µl （≤1:100）的培养物接种至含有 50ml 新鲜培养基的 200mL 三角摇瓶中，28~30℃、250-300r/min 培养过夜 (约 20h)，至 OD600 达到 1.3~1.5； 3. 将细胞培养物于 4℃，1500g 离心 5min，用 50ml 的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；4. 按步骤 3 离心，用 25ml 的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬5. 按步骤 3 离心，用 2-5ml，1M 的冰预冷山梨醇溶液将菌体沉淀重悬； 6. 按步骤 3 离心，用 160µl 的冰预冷的 1mol 的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为 240 ul； 备注：可将其分装为 80 µl 一份的包装 -70 冷冻起来，2 周之内使用，但会影响其转化效率比如常见的 pPIC9K 的载体转 GS115 一般先用 MD 平板初筛，然后长出的克隆子可以挑到不同浓度的含 G418 抗性的 YPD 平板上筛选高拷贝。
对正确筛选出的单菌落接 YPD 小瓶摇活后，转大瓶 BMGY 摇瓶发酵一般对于甲醇诱导菌株，摇瓶一天左右后开始补加甲醇，就类似 BMMY 的功能了 KM71 比 GS115 生长的要慢毕赤酵母都应该是白色菌落的 对于 LOX 家族蛋白的表达，可尝试在酵母培养基中加入 Cu2+ 离子，提高表达量和蛋白活性?菌种保存：挑单克隆到 YPD 中培养 18-24h,然后取菌液以 1:1 加入 30%灭菌甘油， -80 oC ul/管冻存（一般用 10ug 以上质粒用 SalI 酶切，然后直接加乙醇沉淀，70％乙醇洗一遍，约 20ul ddH2O 重溶转化效率一般大于 100 个克隆每 ugDNA建议你不要用胶回收 kit，回收的DNA 可能还有盐，导致电击时放电时间很短 乙醇沉淀主要步骤如下：1）酶切体系（80ul）中 2 倍体积的无水乙醇加 1/10 体积的 PH5.2 NaAC，混匀2)-20℃ 20 分钟沉淀3)13200rpm，20min，离心后弃上清4)75%乙醇 300ul 轻轻洗，同上离心 5min，弃上清5)37 度 烘箱至无乙醇气味（或是用摇床的出风口吹出的暖风吹） 6)20ul ddH2O 重溶）电击转化： 8. 将 5~20 µ g 的线性化 DNA 溶解在 5~10 µ l TE 溶液中，与 80 µ l 的上述步骤 6 所得的菌体混匀，转至 0.2cm 冰预冷的电转化杯中； 9. 将电转化杯冰浴 5min； 10. 根据电转化仪提供的资料，参考其他文献及多次摸索，确定合适的电压、电流、电容等参数，按优化的参数，进行电击； 11. 电击完毕后，马上加入 1ml 1M 的冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至 1.5ml 的 EP管中；（置于 30 度摇床低速培养 1h，再涂板）12. 将菌体悬液涂布于 MD 平板上，每 200~600 µ l 涂布一块平板； 13. 将平板置于 30℃倒置培养，直至单个菌落出现 （3-4 天） 。
推荐：电压 1.5kV ；电容 25µF ；电阻 200 Ω电击时间为 4 ～10msecPichia 酵母表达直接 PCR 鉴定重组子的方法1. 平板上的菌落长到肉眼可见时（约 12 小时） ； 2. 取 1ml 酵母悬液 4000rmp 离心，pbs 重悬，煮沸 5mins，放到冰上 5mins，直接就可以用做 pcr 的模板了3. 将除了模板之外的其它 PCR 反应液的组分准备好，并分装3. 用灭菌的牙签挑取菌落，在 PCR 管中涮一下， PCR 扩增， 利用 5’AOX 1 和 3’AOX 1 引物对转化子进行 PCR 复筛,同时检测基因插入(如果重组质粒以单交换的方式整合到 Pichia pastoris 基因组，则会扩增到两条带，一条为 2.2kb（KM71 为3.6kb）宿主茵 AOXI 基因，另一条为包括目的基因和成熟肽序列和 a-factor 信号肽序列的片段)Each 50 µl aliquot of competent Pichia cells with 3 µg linearized plasmid DNA will yield 50 colonies on selective medium.Muts 表型重组酵母的诱导表达实验 As a general rule when inducing expression, never allow cultures to be more than 10-30% of your total flask volume.1. 挑选一单菌落，置于装有 50ml MGY、BMG 或 BMGY 培养基的 500ml 摇瓶中，于 28-30°C /250-300 rpm 培养至 OD600 = 2-6 (~16-18 h)； 2. 室温下 1500~3000g 离心 5min，收集菌体，用 1/5 到 1/10 原培养体积的 MM, BMM 或 BMMY 重悬菌体（约 2.5~5ml ） ； 3. 将步骤 2 所得的菌液置于 100ml 的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于 28-30 °C/250-300 rpm 的摇床上继续生长； 4. 每 24h 向培养基中添加 100 ％甲醇至终浓度为 0.5 ～1.0% ； 5. 按时间点分别取菌液样品，取样量为 1ml，置于 1.5ml EP 管中，最大转速离心 2~3min ，分别收集上清和菌体，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。
时间点一般取：0 、24 、48、72、96 和 120h； 6. 对分泌表达，分离样品的上清液；对胞内表达，分离样品的菌体沉淀，带检测样品用液氮或干冰速冻后，于-80 °C 保存备用； 7. 可以用 SDS-PAGE、Western-Blot 及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达Mut+表型重组酵母的诱导表达实验 1. 挑选一单菌落，置于装有 25ml MGY、BMG 或 BMGY 培养基的 250ml 摇瓶中，于 28-30°C/250-300 rpm 培养至 OD600 = 2-6 (~16-18 h)； 2. 室温下 1500~3000g 离心 5min，收集菌体，用 MM、BMM 或 BMMY 重悬菌体，使OD600 =1.0 左右（约 100~200ml） ； 3. 将步骤 2 所得的菌液置于 1L 的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于 28-30°C/250-300 rpm 的摇床上继续生长； 4. 每 24h 向培养基中添加 100％ 甲醇至终浓度为 0.5～1.0%； 5. 按时间点分别取菌液样品，取样量为 1ml，置于 1.5ml EP 管中，最大转速离心 2~3min，分别收集上清和菌体，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。
时间点一般取：0、 6、12、24、36、48 、60、72、84 和 96h； 6. 对分泌表达，分离样品的上清液；对胞内表达，分离样品的菌体沉淀，带检测样品用液氮或干冰速冻后，于-80°C 保存备用； 7. 可以用 SDS-PAGE、Western-Blot 及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达 BMGY 和 BMMY 的换液方式有 2 种：1） 一种是离心换液，即在生长培养结束后，转移到灭菌大离心管中，4000rpm 室温离心 5分钟后，用 BMMY 洗下菌体，再转移到摇瓶，整个过程均用灭菌移液管操作2） 另一种是静止换液，即在生长培养结束后，将摇瓶在无菌室静止 4 小时后，直接在酒精灯旁倾倒培养液，再加入诱导培养基，此种方法的缺点有少量生长培养基残留是离心换液或者静止换液，到底那个好，只有根据自己的实验结果来考量如果只是从防治污染的角度来说，静止换液也好一些，因为操作毕竟少一些，速度也快用新开启的分析纯甲醇，一直放在无菌室里面，每次直接用灭菌 TIP 吸取加入摇瓶就可以了也有人试过用膜过滤，结果膜都溶解了菌体是在 BMMY 中培养的，可以不用 BMMY 做对照，在 600nm 处测 OD 值，培养基和 PBS 光吸收都很低，PBS 更方便。
麦芽浸提液培养酵母（不换液，补料），生长阶段结束后，密度可达到 10-12，诱导培养结束后，密度可达到 18 左右如果用 1 体积的 BMGY，在生长阶段结束后，换液时，加入 1/10-1/2 体积的 BMMY 进行诱导培养（即浓缩培养），细胞密度也可达到 20 以上通常，真正的高密度发酵只有在发酵罐里才能实现，OD600 可达到 40-60 及以上摇瓶很难达到那样的密度，不过可以采取浓缩培养的方式实现高密度摇瓶不能像发酵罐那样保证通气量，但可以通过装量来暂时替代这个指标Mut+/Muts 的筛选用 Sac I，Sal I or Stu I 线性化插入 HIS4 位点的载体转化 GS155 后，多数转化子应为 Mut+，但也有 His+Muts 的转化子存在（见 Invitrogen protocol p36） ，Not I or Bgl II 线性化插入 AOX I 位点的载体转化 GS155 后，用 MD/MM 平板可区分 Mut+/MutsUse the plates containing the His+ transformants and screen for the Mut+ and MutS phenotype as described below. 1. Using a sterile toothpick, pick one colony and streak or patch one His+ transformant in a regular pattern on both an MM plate and an MD plate, making sure to patch the MM plate first. 2. Use a new toothpick for each transformant and continue until 100 transformants have been patched (2-3 plates). 3. To differentiate Mut+ from MutS, make one patch for each of the controls (GS115/His+ MutS Albumin and GS115/His+ Mut+ β -gal) onto the MD and MM plates. 4. Incubate the plates at 30°C for 2 days. 5. After 2 days or longer at 30°C, score the plates. Mut+ transformants will grow well on both MD and MM plates. MutS transformants will grow well on MD plates, but show little or no growth on the MM plates. We recommend purifying your His+ transformants to ensure isolation of a pure clonal isolates. You may do this before or after testing for the Mut phenotype. Replica-Plating Procedure This procedure gives a lower rate of misclas。