第四章、免疫组织化学技术第四章、免疫组织化学技术Immunohistochemistry 吉林大学白求恩医学院吉林大学白求恩医学院 组织胚胎学系组织胚胎学系 李树蕾李树蕾2012-11-6 概念概念：： 应用应用免疫学及组织化学原理免疫学及组织化学原理，对，对组织切片或细胞组织切片或细胞标本标本中的某些多肽和蛋白质等中的某些多肽和蛋白质等大分子物质大分子物质进行进行原位定原位定性、定位或定量性、定位或定量研究的技术称为免疫组织化学技术或研究的技术称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术免疫细胞化学技术基本过程基本过程：： 被检抗原被检抗原/半抗原半抗原提取提取→→免疫动物免疫动物→→特异性特异性抗体抗体→→标记抗体标记抗体→→抗原抗体反应部位出现有色沉淀抗原抗体反应部位出现有色沉淀能与对应能与对应抗体抗体结合出现抗原结合出现抗原-抗体反应、又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗体反应、又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗抗原原它只有反应原性反应原性，不具，不具免疫原性免疫原性，又称，又称不完全抗原不完全抗原大多数多糖和所有的类大多数多糖和所有的类脂都属于半抗原。
脂都属于半抗原 免疫酶组织化学免疫酶组织化学免疫荧光组织化学免疫荧光组织化学免疫胶体金组织化学免疫胶体金组织化学亲和免疫组织化学亲和免疫组织化学 （抗原信号放大系统）优点：特异性强，敏感度高，应用广泛优点：特异性强，敏感度高，应用广泛 第一节第一节 免疫组织化学基本原理免疫组织化学基本原理一、一、直接法直接法 用用酶酶或其它标记物或其它标记物标记的特异性抗体标记的特异性抗体直接与标本中直接与标本中的相应的相应抗原抗原结合，再与结合，再与酶的底物酶的底物作用产生作用产生有色产物有色产物沉积沉积，在抗原抗体反应的部位即可检测在抗原抗体反应的部位即可检测 优点：优点：简单快速，简单快速，特异性特异性强，强，非特异性非特异性反应低；反应低；缺点：缺点：敏感性差敏感性差；抗原量要求高；；抗原量要求高；很难获得各种市售标记很难获得各种市售标记抗体肿瘤蛋白标记物：低丰度蛋白）抗体肿瘤蛋白标记物：低丰度蛋白）在免疫荧光和免疫酶技术中因材料处理不当或用量不当产在免疫荧光和免疫酶技术中因材料处理不当或用量不当产生的背景着色反应生的背景着色反应 第一抗体（第一抗体（兔兔）不标记，使用与）不标记，使用与一抗一抗种属相同抗体种属相同抗体的的FcFc段段（有种属特异性）作为抗原（有种属特异性）作为抗原免疫动物（羊），免疫动物（羊），制备制备抗抗抗体，即抗体，即第二抗体（羊抗兔），第二抗体（羊抗兔），并并标记第二抗体标记第二抗体。
二、二、间接法间接法染色时，顺次以染色时，顺次以第一抗体第一抗体和和标记的第二抗体标记的第二抗体处理标处理标本，在抗原存在部位形成本，在抗原存在部位形成抗原抗原- -第一抗体第一抗体- -标记第二标记第二抗体复合物抗体复合物，以达到检测，以达到检测该抗原的目的该抗原的目的 优点：优点：间接法因第二抗体的放大作用敏感性大间接法因第二抗体的放大作用敏感性大大增高（放大原理大增高（放大原理=抗原：抗体抗原：抗体1：：6））；；缺点：缺点：可能出现非特异性反应；可能出现非特异性反应；子宫内膜巨噬细胞移动抑制因子MIF 三、亲和三、亲和免疫免疫组织化学化学(一一)亲和素亲和素-生物素生物素-过氧化物酶复合物法过氧化物酶复合物法 (avidin-biotin-peroxidase complex method，，ABC法法)特点特点: 以以亲和素亲和素作为作为“桥桥”将将生物素结合的酶生物素结合的酶和和生物素化的抗生物素化的抗体体连接起来，使抗原与抗体反应信号放大，以增加敏感性连接起来，使抗原与抗体反应信号放大，以增加敏感性 1.1.原理原理: :o生生物物素素 (biotin)为为含含硫硫的的杂杂环环单单羧羧酸酸，，生生物物素素分分子子量量为为244.31，，pI为为3.5，，咪咪唑唑酮酮环环（（又又称称Ureido环环））(I环环)是是与与亲亲合合素素结结合合的的主主要要部部位位；；Ⅱ环环为为噻噻吩吩环环有有一一个个戊戊酸酸侧侧链链，，末末端端羧羧基基是是标记抗体和酶的唯一结构。
标记抗体和酶的唯一结构 o亲亲和和素素 (avidin)又又称称抗抗生生物物素素蛋蛋白白，，是是一一种种糖糖蛋蛋白白，，分分子子量量为为6.8KD，，pI 10～～10.5；；在在pH9～～13缓缓冲冲液液中中性性质质均均稳稳定定天天然然亲亲合合素素为为碱碱性性蛋蛋白白，，由由4个个相相同同的的亚亚单单位位构构成成4聚聚体体；；每每个个亲亲合合素素亚亚单单位位通通过过其其结结构构中中的的色色氨氨酸酸残残基基与与生生物物素素中中的的Ureido环环（（I环环））结结合合因因此此，，1个个亲亲合合素素分分子子存存在在4个与生物素分子结合位点个与生物素分子结合位点 ABC法法 链霉亲和素链霉亲和素-生物素生物素-过氧化物酶复合物法过氧化物酶复合物法SABC法原理法原理 2. 免疫组织化学酶类标记物免疫组织化学酶类标记物 免疫组化标记物的酶以共价键结合在抗体上，免疫组化标记物的酶以共价键结合在抗体上，SABC法则采用生物素法则采用生物素-亲和素系统，制成酶标抗体，亲和素系统，制成酶标抗体，再借助酶对底物的特异催化作用，生成有色不溶沉再借助酶对底物的特异催化作用，生成有色不溶沉淀，在光镜下进行各种抗原成分观察淀，在光镜下进行各种抗原成分观察 。
常用酶类：辣根过氧化物酶常用酶类：辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，，HRP), 碱性磷酸酶碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，，AP) 用于标记的酶的特性用于标记的酶的特性o酶催化反应形成的产物易于在光镜下观察酶催化反应形成的产物易于在光镜下观察o酶反应终产物是稳定的沉淀，不会从酶活性部酶反应终产物是稳定的沉淀，不会从酶活性部位向四周弥散而影响组织学定位位向四周弥散而影响组织学定位o较易获得纯的酶分子较易获得纯的酶分子o中性中性PH值时，酶分子稳定值时，酶分子稳定o酶连接在抗体上，二者活性均不受影响酶连接在抗体上，二者活性均不受影响 HRP底物底物: 过氧化物：过氧化氢过氧化物：过氧化氢 供氢体：二氨基联苯胺供氢体：二氨基联苯胺 (Diaminobenzidine,DAB) 3-氨基氨基-9乙基咔唑乙基咔唑 (3-amino-9- ethylcarbozole, AEC) DAB + H2O2 棕色；棕色； AEC + H2O2 紫红色紫红色AP磷酸酯水解酶，磷酸酯水解酶， 溴氯羟吲哚磷酸盐溴氯羟吲哚磷酸盐(底物）底物）/硝基蓝四唑硝基蓝四唑 (BCIP/NBT) 溴氯羟吲哚磷酸盐溴氯羟吲哚磷酸盐(底物）底物）/硝基硝基四紫唑四紫唑 (BCIP/INT) NBT/BCIP 蓝紫色蓝紫色 INT/BCIP 棕红色棕红色或或橘黄色橘黄色 HRPHRPAPAP ABC法的法的优点优点：敏感性更高：敏感性更高ABC法的法的缺点缺点：：①①亲和素亲和素(鸡蛋白鸡蛋白)中含有中含有10%糖类，导致背景着色糖类，导致背景着色②亲和素的等电点约亲和素的等电点约10左右，带较多的负电荷，导致纤维左右，带较多的负电荷，导致纤维组织着色。
组织着色③③内源性生物素导致背景着色内源性生物素导致背景着色④④亲和素中有亲和素中有4个结合点，其中一半与连接抗体结合，另一个结合点，其中一半与连接抗体结合，另一半与复合物结合，可降低其敏感性半与复合物结合，可降低其敏感性 (二二)链霉菌抗生物素蛋白链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶法过氧化酶法 （Streptavidin-peroxidase method，SP法）o 链霉亲和素替代链霉亲和素替代ABC法中的亲和素法中的亲和素-生物素复生物素复合物，形成链霉菌抗生物素蛋白合物，形成链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶法，过氧化酶法，SP法 Ag1Ab2AbDABABC methodDABSP methodA-B-ComplexSa-P-ComplexPABPSa放大系统放大系统→← 1.链霉亲和素链霉亲和素SA（链霉菌抗生物素蛋白）约（链霉菌抗生物素蛋白）约6.5KD，由，由4条相同肽链构成，每条肽链可结合条相同肽链构成，每条肽链可结合1个生物素分子每个生物素分子每个个SA有有4个生物素结合位点，结合常数与个生物素结合位点，结合常数与A相同为相同为1015mol/L，约为抗原抗体间，约为抗原抗体间ka（（105～～1011 mol/L)的的1万倍以上。
万倍以上 SA最高的活性可达最高的活性可达18u，较，较A高（高（15u）；）；SA的四个亚基可以全部和二抗上的生物素结合的四个亚基可以全部和二抗上的生物素结合2.链霉亲和素组织穿透性强，反应速度快链霉亲和素组织穿透性强，反应速度快3.等电点为等电点为5.5~6.7，接近中性，所带的负电荷少；，接近中性，所带的负电荷少；4.链霉亲和素不含糖基链霉亲和素不含糖基SP法的优点法的优点 第二节、免疫组织化学染色步骤第二节、免疫组织化学染色步骤一、免疫组化染色步骤一、免疫组化染色步骤（一）石蜡切片（一）石蜡切片1.1.烤片：烤片：58℃ 2-58℃ 2-６６h h；； 目的：带蜡的组织切片牢固黏在载玻片上目的：带蜡的组织切片牢固黏在载玻片上 注意：高温加速组织中抗原氧化注意：高温加速组织中抗原氧化2.2.脱脱腊腊和和水水化化：：二二甲甲苯苯ⅠⅠ、、ⅡⅡ中中浸浸泡泡15min15min脱脱蜡蜡→→100﹪100﹪酒酒 精精 ⅠⅠ、、 ⅡⅡ中中 分分 别别 浸浸 泡泡 5min→95﹪5min→95﹪、、90﹪90﹪、、80﹪80﹪、、70﹪70﹪酒酒精精各各浸浸泡泡2min→PBS2min→PBS洗洗3 3次次×3min,×3min,置蒸馏水中待用；置蒸馏水中待用； 3.3.抗抗原原修修复复：：甲甲醛醛形形成成醛醛键键、、羧羧甲甲基基等等封封闭闭部部分分抗抗原原决决定定簇簇；；蛋蛋白白分分子子交联隐蔽了抗原决定簇。
交联隐蔽了抗原决定簇 加热修复加热修复 ：：①①高高压压修修复复：：pH pH 6.06.0的的0.1mol0.1mol／／L L柠柠檬檬酸酸缓缓冲冲液液高高压压锅锅内内煮煮沸沸，，切切片片置置于于其其中中, ,高高压压修修复复1.5min1.5min，，室室温温冷冷却却，，蒸蒸馏馏水水和和PBSPBS各各冲冲洗洗2 2次次×3min×3min；； 注意：时间过长背景加深；新鲜柠檬酸缓冲液；缓冲液足量注意：时间过长背景加深；新鲜柠檬酸缓冲液；缓冲液足量②②微微波波修修复复：：pH pH 6.06.0的的0.1mol0.1mol／／L L柠柠檬檬酸酸缓缓冲冲液液微微波波煮煮沸沸，，切切片片置置于于其其中中，，中中高高档档微微波波处处理理15-20min15-20min，，室室温温冷冷却却，，蒸蒸馏馏水水和和PBSPBS各各冲冲洗洗2 2次次×3min×3min；； ③③蒸蒸汽汽修修复复: 内内，，盛盛自自来来水水的的铝铝制制容容器器加加热热至至水水沸沸腾腾, ,放放入入含含pH pH 6.06.0的的0.1mol0.1mol／／L L柠柠檬檬酸酸缓缓冲冲液液和和切切片片的的盖盖容容器器. .继继续续沸沸腾腾10-15min,10-15min,室室温温冷却冷却. . ( (强烈推荐强烈推荐) ) 胰蛋白酶消化胰蛋白酶消化：细胞内抗原：细胞内抗原 0.1%0.1%胰胰酶酶溶溶液液（（0.1%0.1%氯氯化化钙钙 pH7.8 pH7.8 ）），，3737℃℃，，15-30 15-30 minmin，，, ,PBSPBS冲洗冲洗3 3次次×3min×3min；； 胃蛋白酶消化胃蛋白酶消化：细胞间质抗原：细胞间质抗原 0.4%0.4%，，3737℃℃，，30-180 min30-180 min注意注意: :酶溶液新鲜配制酶溶液新鲜配制; ;或分装冻存或分装冻存; ;要预热要预热建建议议：：仔仔细细阅阅读读抗抗体体说说明明书书，，是是否否需需要要进进行行抗抗原原修修复复，，选选择择合合适适的抗原修复方法和时间。
的抗原修复方法和时间 单单一一方方法法无无效效, ,可可联联合合应应用用, ,适适合合于于免免疫疫组组化化双双重重标标记记或或多多重标记重标记. . 4.4.细胞膜打孔细胞膜打孔 0.1﹪-0.30.1﹪-0.3％％tritonX-100tritonX-100浸泡，浸泡，RTRT，，25min25min，，PBSPBS冲洗冲洗3 3次次×5min×5min 原理原理: tritonX-100: tritonX-100为脂溶性去垢剂为脂溶性去垢剂 注意：检测膜抗原可省略此步骤注意：检测膜抗原可省略此步骤 使抗体渗透进入细胞的方法使抗体渗透进入细胞的方法（（1 1）） Triton X-100 Triton X-100 ：使细胞膜脂类溶解：使细胞膜脂类溶解 （（2 2）） Np-40Np-40：使细胞膜蛋白质破环：使细胞膜蛋白质破环 （（3 3）） SaponinSaponin皂苷：使细胞膜胆固醇溶解皂苷：使细胞膜胆固醇溶解 5.灭活内源性酶及封闭内源性生物素灭活内源性酶及封闭内源性生物素（（1 1））灭灭活活内内源源性性过过氧氧化化物物酶酶：：3﹪3﹪甲甲醇醇-H-H2 2O O2 2浸浸泡泡，，RTRT，，30min30min，，PBSPBS冲洗冲洗3 3次次×5min×5min；；（（2 2））灭灭活活碱碱性性磷磷酸酸酶酶：：以以每每毫毫升升24mg24mg左左旋旋咪咪唑唑加加入入底底物物液液中，保持中，保持PH7.6PH7.6－－8.28.2。
酸性磷酸酶用酸性磷酸酶用0.05M0.05M酒石酸抑制酒石酸抑制3 3））灭灭活活内内源源性性生生物物素素：：加加生生物物素素阻阻断断剂剂A A液液（（0.01%0.01%亲亲和和素素））1 1滴滴，，RTRT，，10min10min，，PBSPBS冲冲洗洗3 3次次×2min×2min；；加加B B液液（（生生物物素素））1 1滴滴，，RTRT，，1010分分钟钟，，PBSPBS冲冲洗洗3 3次次×2min×2min；；此此步步骤骤适适用用于富含生物素的组织（如脑和胚胎组织）于富含生物素的组织（如脑和胚胎组织） 6.6.非免疫血清封闭：非免疫血清封闭： 原因：富含正电荷的胶原和结缔组织吸附抗体原因：富含正电荷的胶原和结缔组织吸附抗体 目的：吸附带正电荷的蛋白目的：吸附带正电荷的蛋白 操操作作：：与与二二抗抗种种属属相相同同的的非非免免疫疫血血清清或或2-2-5﹪BSA5﹪BSA（牛血清白蛋白），（牛血清白蛋白），RTRT，，10min10min，不洗；，不洗； 注意注意：结合不牢固，不能冲洗：结合不牢固，不能冲洗 建建议议：：可可试试用用不不同同动动物物的的非非免免疫疫血血清清（（尽尽量量不不要与一抗种属相同）要与一抗种属相同） 7.7.加加入入一一抗抗 4℃4℃过过夜夜，，或或3737℃℃孵孵育育1-2h1-2h，，PBSPBS冲冲洗洗3 3次次×5min×5min多克隆抗体兔多抗价格低，效价高非特异性反应高，效价不稳定单克隆抗体小鼠单抗大鼠单抗兔单抗特异性强，无交叉反应，效价稳定价格高，效价低浓缩型抗体摸索效价市售抗体稀释液，或含1-3%非免疫血清PBS即用型抗体无需摸索效价 8.8.加加入入生生物物素素标标记记IgGIgG( (二二抗抗）），，RT,10RT,10分分钟钟，，PBSPBS冲洗冲洗3 3次次×5min×5min；； 注意：与一抗匹配注意：与一抗匹配9.9.加加入入链链霉霉亲亲和和素素- -生生物物素素- -辣辣根根过过氧氧化化物物酶酶/ /碱碱性性磷磷酸酸酶酶（（SABC-PODSABC-POD，，或或SABC-APSABC-AP）），，RT,10minRT,10min，，PBSPBS冲洗冲洗4 4次次×5min×5min 10.10.AEC或或DAB（（ 或或NBT/BCIP ））显显色色 显显色色过过程程为为2 2～～10min10min（（镜镜下下监监控控，，AECAEC不不能能长长期期保保存存）），，蒸馏水或自来水冲洗；蒸馏水或自来水冲洗；11.AEC11.AEC和和NBT/BCIP显显色色直直接接用用水水溶溶性性封封片片剂剂封封片片。
12. 12. 苏木精复染（苏木精复染（1010秒钟），自来水冲洗返蓝秒钟），自来水冲洗返蓝13.13.苏木精染色则经过脱水透明，用中性树胶封片苏木精染色则经过脱水透明，用中性树胶封片14.14.镜下检查结果镜下检查结果 DAB显色 ChATChAT免疫组化免疫组化检测结果检测结果AEC显色 Prostate – Double label • Cytokeratin 5 (m), AP substrate (blue) CD34 (m), AEC （red） 。