1一氧化氮―一氧化氮合酶系统与骨折愈合【关键词】一氧化氮一氧化氮(nitricoxide，NO)是在一氧化氮合酶(nitricoxidesythase,NOS)作用下氧化产生的一种小分子自由基气体由于其分子量小，脂溶性及化学性质活泼，因而极易透过生物膜，是细胞间、细胞内的重要信使分子由于其合成易于调节，作为高级生物体，调节的有效信号在循环、呼吸、消化及内分泌代谢等系统中发挥着重要作用近几年来的研究发现，NO―NOS 系统对骨折愈合起重要作用本文就 NO―NOS 系统对骨折愈合的影响作一综述1NO 在骨组织中的合成NO 由 L 精氨酸(LArginine)氧化途径产生，限速酶是 NOS目前已证实骨组织中存在全部 3 个 NOS 亚型［1］ 神经元型(nNOS，NOS1)是 Ca2+／钙调蛋白(CaMP)依赖的，主要存在于神经元和某些上皮细胞但破骨细胞(osteoclast，OC)和成骨细胞(osteoblast，OB)体外培养中未发现，可能其来自于分布于骨组织内血管中膜的神经组织诱生型(iNOS，NOS2)不依赖Ca2+／CaMP 可被细菌脂多糖(LPS)和或肿瘤坏死因子(TNF)、IL1 等诱导表达，主要存在于巨噬细胞、星形胶质细胞、中性粒细胞、内皮细胞等。
内皮型(eNOS,NOS3)也是 Ca2＋／CaMP 依赖型，多见于内皮细胞OC 和破骨前体细胞(osteoclastprogenitor)、OB 和骨细胞(osteocyte)均既能表达 eNOS，又能表达iNOS在骨的微环境中，许多细胞可以产生 NO，如 OC 和成骨细胞(osteoeyte)但对 NO 在骨的合成部位却了解不多有学者用免疫组化方法降低尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸黄递酶(NADPHd)技术来确定 NO 在骨的活性部位Schmidt［2］认为，NADPHd 活性存在于鼠长骨 OC 内，但这些细胞不能与 NOS 特异抗体结合也有人证实，活体 NADPHd 活性存在于 OC,但不清楚这种活性是否来自 NOS免疫学定位研究表明，ecNOS 或 NOS 存在于新分离培养的大鼠 OC 和用 LPS 培养的大鼠长骨 OC 中免疫组化和原位杂交研究证明，骨髓巨噬细胞是 iNOS 活性最主要的来源2NOS 在骨折愈合过程中的表达及定位不同类型的 NOS 在骨折愈合的不同时期，它们表达的强弱也有所不同人和大鼠骨折过程中均发现了 3 种 NOS 的存在，而在非骨折的股骨皮质中未发现三种NOSmRNA 的表达不同及酶的活性。
在骨折愈合过程中，3 种 NOS 异构体表达分布不一样，即表现为时间相关性、细胞分布差异性Corbett 等［３］应用免疫组织化学、蛋白印迹(Westernblots)、L 瓜氨酸酶法证实：在骨折愈合早期，皮质骨血管和骨细胞强烈表达 eNOS 骨折后 1d 酶可观察到活性；iNOS 在骨内膜成骨细胞和成软骨细胞内表达水平下降(尤其是骨折后第 2 周)；骨折端则没有 nNOS的表达eNOS 的增高和 iNOS 的下降在骨折愈合早期是非常重要的，两者均可促2进骨折愈合Zhu 等［4］通过半定量竞争性 PCR 发现，在大鼠股骨骨折后第 4d，3 种类型的 NOSmRNA 的表达都增加iNOS 在骨折后 4、7d 表达最多，主要分布于骨膜骨痂和皮质骨表面的细胞内，骨折后 14d 骨痂中 iNOS 下降到不可检测的水平；eNOS 在骨折后 7、14d 表达最多，主要分布于软骨区和血管周围的细胞内；nNOS在骨折后 14、21d 表达最多，主要分布于纤维软骨区内纤维组织和骨痂间的区域并推测在骨折愈合的不同时期应用不同的 NOS 抑制剂或刺激剂可以调节骨折的修复尽管不同学者研究的结果有所不同，但结论共同点为 3 种类型的 NOS 在骨折愈合的不同时期表达具有类型特异性和实践依赖性。
而 iNOS 和 eNOS 间互相制约：iNOS 的增加伴随着 eNOS 的减少，或者 eNOS 的增加伴着 iNOS 的减少3NONOS 系统在骨折愈合中的生物学作用31 调节骨折部位的血管反应充足的血流供应、适当的血管反应对骨折的愈合起着关键作用骨折后的最初 30min 内局部血流量减少，24h 后恢复正常，而 3d 后血流量增加了 3 倍血流增多可能是由于局部血管的舒张和新生血管的生成NO 在各种病理生理情况下可能是最有效的血管扩张剂和血管形成的介质它在乙酞胆碱的作用下由内皮细胞合成和释放，通过松弛附近平滑肌而使血管扩张Corbett 等［5］发现，在骨折修复过程中，NO 对血管结构具有功能性的时间依赖性效应骨折愈合早期，特别是在骨折后第 1dNO 依赖性血管反应最强，并且局限于骨折部位长骨骨折早期，骨折断端的血流是降低的，在 NO 作用下，血流在几小时内将恢复，并且随骨折愈合进程显著增加NO 主要通过增加血管平滑肌内 cGMP 水平，使骨折部位的血管扩张，从而使骨折端血流增加，促进骨折愈合同时，NO 可调节骨髓的血液供应，加速生成血细胞，增加循环血流量由此推测，eNOS 的表达可增加些流量，改善局部微循环，从而增强骨痂的生物力学性能。
32 调节碱性磷酸酶的活性碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)的活性反映了成骨细胞的成骨活性ALP 是成骨细胞分化的早期指标，其作用是水解有机磷酸释放无机磷，用于羟基磷灰石的形成，因此是骨形成的特异性酶NamkungMatthai 等［6］对大鼠股骨骨折后第 4、7、14、28d 的骨痂组织块培养发现，骨折后第 7d 的骨痂组织块ALP 的活性最高，而骨折后第 14d 的骨痂组织块 ALP 的活性最低在培养液中用NOS 抑制剂 S(2aminoethyl)isothiouroniumbromidehydromide 与骨痂组织块共同孵化，上述 4 个时间点的骨痂组织块的 ALP 活性均下降 50％，而低剂量(025mmol／L)补充 NO 供体 3morpholinosydnonominehydrochloride(SIN1)则可使 ALP 活性增加 20％ALPmRNA 和 ALP 被发现定位在骨痂内成骨细胞样细胞和软骨细胞样细胞内33NONOS 系统对 OC 的影响3OC 是骨中 NO 的来源之一，通过辅酶Ⅱ黄递酶染色，OC 呈强阳性，证实了OC 自身可生成 NO。
目前认为 NO 对 OC 的作用主要涉及以下环节：331 使 OC 胞浆收缩，降低 OC 表面积，改变 OC 形状，抑制 OC 在骨基质上粘附和质子泵分泌 H+功能，并直接抑制 OC 粘附机制，特别是整合素(integrin)α、β３表达，引起 OC 脱离吸收部位，类似降钙素的 R 效应(retractionaction)但并不影响细胞膜的运动，这是与降钙素作用的不同点332 抑制破骨细胞前体增殖进而抑制 OC 形成在分离的鼠 OC 培养基中加入高浓度可溶性 NO 气体(30μmolL1)和 NO 生成剂硝普盐(>001mmolL1)可抑制骨吸收001mmolL１的硝普盐还可抑制甲状旁腺(PTH)刺激骨吸收虽然 NO 在骨的产生与细胞内的 cGMP 蓄积有关，但 cGMP 的类似物可能对骨吸收没有直接作用基础浓度的 NO 是维持 OC 正常骨吸收功能所必需，适当低浓度 NO 可促进破骨细胞前体向 OC 转化低浓度 NO 还可增强 IL1β、TNFα 诱导的 OC 性骨吸收，如 IL1β、TNFα 联合作用产生的低浓度 NO，对骨吸收有显著刺激作用；低浓度的 NO 供体 S 亚硝基乙酰青酶胺(SNAP)可增强 IL1β 诱导的骨吸收。
在炎症条件下激活的 T 淋巴细胞可产生 γ 干扰素(IFNγ)，而 IFNγ 可诱导 NO 的产生，抑制由 IL1 与肿瘤坏死因子(TNF)引起的骨吸收并伴有 OC 数目减少；风湿性关节炎患者的 IFNγ 低于对照组精氨酸的类似物硝基 L 精氨酸甲酯(LNMMA)可完全阻断 NO 的产生这些资料表明，高浓度的 NO 不仅抑制成熟 OC 的骨吸收而且还可抑制 OC 的产生由此可见，NO 对骨的吸收有双重调节作用即：高浓度 NO 经抑制 OC 形成和抑制成熟的 OC 吸收功能而抑制骨吸收；而低浓度 NO 则增强细胞素诱导的骨吸收，并且对正常的 OC 功能来说是必不可少的［7］ 34NONOS 系统对OB 的影响最近的研究表明，OB 是骨组织中 NO 的又一重要来源自然状态下测定培养中的正常人松质骨来源的 OB，发现其几乎不产生 NO目前认为即使有 NO 产生，其基础水平也较低［8］ 炎性疾病时可激活 iNOS 途径以增加 NO 产量，说明细胞因子诱导增加 NO 的产生是通过激活 iNOS 的合成关于 NO 对其靶细胞的作用机制目前尚不完全清楚，归纳起来有如下途径：341NO 可与靶细胞内鸟苷酸还化酶结合，提高该酶活性，增加细胞内环磷酸鸟苷(cGMP)含量，以 cGMP 为第 2 信使发挥其生物学作用。
但 cGMP 类似物二丁基cGMP 和 8 溴 cGMP 对 NO 靶细胞无 NO 样作用不支持此观点342 由于 NO 可使 OC 形态发生变化，所以有学者提出 NO 作用机理可能通过某些蛋白激酶或某些功能蛋白影响细胞骨架而起作用有研究显示：NO 对 OB 的影响存在一个阈值问题，中等量的 NO 似乎对维持OB 的生长十分必要当 NO 的合成超出阈值时，NO 对 OB 有抑制作用，甚至毒性作用NOS 竞争性抑制剂 LNMMA 可抑制人或鼠 OB 增生，并呈剂量依赖性在培养液中增加 L 精氨酸的浓度或补充 NO 供体可阻止这种效应ecNOS 在 Ros17／284细胞、MG63 细胞和人原始成骨细胞中表达这些资料显示，适当剂量的 NO 对调节 OB 的生长有重要作用高浓度 NO 还可抑制前 OB 内 3H 胸腺嘧啶(3HTdR)摄入量［9］ ，抑制前成骨细胞增殖，影响 OB 的形成此外，较高浓度的 NO 可促进OB 凋亡，通过环氧酶(COX)旁路抑制 OB 碱性磷酸酶(ALP)活性并阻断前列腺素(PG)对 OB 的作用，并抑制 OB 合成反映其活性的标记物骨钙素(BGP)，从而抑制骨质矿化。
35NONOS 系统对软骨细胞的影响正常情况下，软骨细胞几乎不产生 NO，且正常软骨细胞中亦无 iNOS 分布，而用 IL1、肿瘤坏死因子 α(TNFα)等激活后，iNOS 分布明显增加，iNOS 选择性抑制剂作用于骨关节炎软骨，NO 的产生明显减少软骨细胞需在 IL1 等细胞因子的诱导下通过 iNOS 催化产生 NONO 对软骨细胞功能的调节：(1)抑制软骨细胞增殖：其作用机制可能有：①可能通过 cGMP 增加，抑制 DNA 合成，从而抑制软骨细胞增殖［10］ ；②NO 可能促进前列腺素(PGE2)的产生，通过 PGE2 抑制软骨细胞增殖；③NO 可能促进碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的合成释放，通过 bFGF 抑制软骨细胞的增殖；(2)抑制软骨细胞的迁移、粘附：软骨细胞的迁移、粘附对软骨的生长、发育有重要作用，IL1 等细胞因子激活软骨细胞产生的 NO 抑制软骨细胞的迁移，也抑制软骨细胞粘附到纤粘连蛋白(Fn)上，从而削弱软骨的修复能力［11］ ；(3)诱导软骨细胞凋亡：NO 供体在体外可诱导软骨细胞凋亡，IL1 和氧自由基清除剂一同作用于软骨细胞可引起细胞凋亡，在 NO 产生减少的情况下，氧自由基引起软骨细胞死亡，不是氧自由基而是 NO 引起软骨细胞凋亡；(4)引起或促进软骨细胞死亡：H2Ｏ2 加入到 IL1／TNF 处理和未处理的软骨细胞中，前者的 LD50 仅是后者的十分之一，且增加的酶感性可被 NOS 抑制剂彻底消除，NO 可能通过减弱软骨细胞的去氧化剂的毒性作用直接引起或间接促进软骨细胞死亡；(5)干扰软骨细胞内、外信息的传递：NO 供体或炎性细胞因子可阻断 Fn 和。