单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第七章 细胞融合与应用,第一节 细胞融合概述,细胞融合（cell fusion),，,又称体细胞杂交（somatic hybridiazation），是指两个或更多个相同或不同细胞通过膜 融合形成单个细胞的过程一、细胞融合的定义,Muller,于,1838,年观察到脊椎动的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞Virchow,于,1858,年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象Luginbuhl,于,1873,年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在Lange,于,1875,年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程Cienkawski(1876),、,Buck(1877),、,Geddes(1880),在无脊椎动中发现了细胞合并现象1958,年日本学者冈田（,Okada,）发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应1974,年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（,PEG,）化学融合法1975,年,Kohler,和,Milstein,成功地融合了小鼠,B-,淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。
20,世纪,80,年代出现了电融合技术二、细胞融合研究历史,生物种类,细胞来源,成功年代,烟草两个种间,苷蓝青菜,大豆马唐草,矮牵牛龙面花,大麦花生,大麦大豆,小麦矮牵牛,油菜大豆,玉米大豆,大豆野豌豆,大麦蚕豆,大豆草香木犀,酵母菌鸡,大豆烟草,大豆秋水仙,人胡萝卜,番茄马铃薯,人小鼠,叶叶,叶根,愈伤组织叶,叶花瓣,种子种子,叶悬浮细胞,叶花瓣,叶悬浮细胞,叶悬浮细胞,悬浮细胞悬浮细胞,叶根,悬浮细胞叶,原生质体血红细胞,悬浮细胞叶,悬浮细胞叶,腹水癌细胞原生质体,叶根尖,纤维肉瘤细胞畸胎瘤细胞,1972,1972,1972,1973,1974,1974,1974,1974,1974,1974,1975,1976,1976,1976,1976,1976,1978,1978,几种细胞融合成功的例子,植物融合细胞成长状态对比,右瓶为地面融合的细胞，左瓶中为太空微重力环境下融合的细胞,动物细胞融合实验使用的小白鼠,三、动植物细胞的融合过程,植物细胞融合过程,人造小鼠培育过程示意图,四、细胞融合的意义,理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。
融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体,DNA,亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备第二节 细胞融合的基本原理,显微镜下细胞融合过程,融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程图解,第三节 细胞融合的常用方法,物理法：显微操作，电场刺激等,化学法：硝酸钠诱导、PEG结合高pH，高钙离子法p167,生物法：仙台病毒法,一、仙台病毒法,仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段：,两种细胞在一起培养，加入病毒，在4条件下病毒附着在细胞 膜上并使两细胞相互凝聚；,在37中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此时需要Ca,2+,和Mg,2+,，最适PH为8.0一8.2；,细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需Ca2+和ATP；,融合成巨大细胞，仍需ATP基本原理：是利用病毒具有凝集细胞的能力,病毒法的主要步骤,两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近；,通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透；,两个原生质体的细胞核互相融合，两个细胞融为一体；,进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种细胞。
用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图,聚乙二醇,(PEG),结构为：,HOH,2,C,（,CH,20,CH,2,）,n,CH,2,OH,，分子量大于,200,小于,6000,者均可用作细胞融合剂PEG,浓度以,W/W,；如将,10,克,PEG,与,10mlEagLe,氏液混合（假定,1ml,培养液为,1g,重,),，即成,50,PEG,溶液PEG,经高压灭菌后，与温热的,Engle,氏液混合通常用分子量低于,1000,的,PEG,作融合剂最好，,50,PEG,溶液能产生 最多杂交细胞PEG,溶液在,pH6.0,时细胞融合率最高优点是易得，用法简单，融合效果稳定二、聚乙二醇（PEG）法,聚乙二醇（PEG）法细胞融合过程,PEG,的作用机理,：,Kao,等认为，由于,PEG,分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成,H,键，从而在质膜之间形成分子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合；另外，,PEG,能增加类脂膜的流动性，也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能PEG,诱导融合的特点：,其优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。
其缺点是融合过程繁琐，,PEG,可能对细胞有毒害1）将两种不同亲本细胞各5l0,6,混匀；,（2）离心沉淀，吸去上清液；,（3）加1ml 50PEG溶液，用吸管吹打，使之与细胞接触1分钟；,（4）加9ml 培养液，离心沉淀，吸去上清液；,（5）加5ml 培养液，分别接种5个直径60mm平皿，每个平皿加培养液至 5ml，37的CO,2,培养箱中培养6）624小时后，换成选择培养液筛选杂交细胞聚乙二醇（PEG）法细胞融合步骤,PEG诱导的细胞融合过程示意图,三、电融合法,电融合法是80年代出现的细胞融合技术，在直流电脉冲的诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变，使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜，形成融合体电融合法的优点：,融合率高、重复性强、对细胞伤害小；,装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程；,免去,PEG,诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强细胞膜的接触：,当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；,膜的击穿：,原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。
电融合法的基本过程,电融合诱导法原理示意图,第三节 杂种细胞的筛选,根据已经发生融合的细胞中所含有核的类型，可将其分为以下几种类型：,异核细胞：非同源细胞的融合体同核细胞：两个相同细胞的融合体多核细胞：含有双亲不同比例核物质的融合体杂种细胞筛选方法：,1遗传互补筛选法,2抗性互补筛选,3生长特性筛选法,4物理特性筛选法,5其它方法,基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂种筛选,基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选,由温度敏感型细胞组成的杂种细胞的筛选,具有所需性状杂种细胞的筛选,常用的杂种细胞筛选方法,第四节 细胞融合技术应用举例,动物细胞融合单克隆抗体生产,利用原生质体融合和培养技术培育新植物,微生物原生质体融合构成新菌株,一、何谓单克隆抗体？,应用1：细胞杂交瘤技术与单克隆抗体,只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体,T淋巴细胞,：即胸腺依赖淋巴细胞（thymus dependent lymphocyte）亦可简称T细胞来源于骨髓的多能干细胞（胚胎期则来源于卵黄囊和肝）目前认为，在人体胚胎期和初生期，骨髓中的一部分多能干细胞或前T细胞迁移到胸腺内，在胸腺激素的诱导下分化成熟，成为具有免疫活性的T细胞。
成熟的T细胞经血流分布至外周免疫器官的胸腺依赖区定居，并可经淋巴管、外周血和组织液等进行再循环，发挥细胞免疫及免疫调节等功能T细胞的再循环有利于广泛接触进入体内的抗原物质，加强免疫应答，较长期保持免疫记忆T细胞的细胞膜上有许多不同的标志，主要是表面抗原和表面受体这些表面标志都是结合在细胞膜上的巨蛋白分子人类免疫系统的介绍,外分泌淋巴系统：呼吸道和生殖泌尿系统,内分泌淋巴系统：胸腺、骨髓、脾脏、扁桃体、淋巴结等,B淋巴细胞,：来源于骨髓的多能干细胞在禽类是在法氏囊内发育生成，故又称囊依赖淋巴细胞（bursa dependent lymphocyte）/骨髓依赖性淋巴细胞简称B细胞，是由骨髓中的造血干细胞分化发育而来与T淋巴细胞相比，它的体积略大这种淋巴细胞受抗原刺激后，会增殖分化出大量浆细胞浆细胞可合成和分泌抗体并在血液中循环成熟的B细胞经外周血迁出，进入脾脏、淋巴结，主要分布于脾小结、脾索及淋巴小结、淋巴索及消化道粘膜下的淋巴小结中，受抗原刺激后，分化增殖为浆细胞，合成抗体，发挥体液免疫的功能B细胞在骨髓和集合淋巴结中的数量较T细胞多，在血液和淋巴结中的数量比T细胞少，在胸导管中则更少，仅少数参加再循环。
B细胞的细胞膜上有许多不同的标志，主要是表面抗原及表面受体这些表面标志都是结合在细胞膜上的巨蛋白分子B1细胞为T细胞非依赖性细胞B2为T细胞依赖性细胞B细胞在体内存活的时间较短，仅数天至数周，但其记忆细胞在体内可长期存在B细胞淋巴瘤是一种最常见的淋巴细胞白血病，有关这种疾病的研究不断涌现单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞(myeloma cell)与经特定抗原免疫刺激的B淋巴细胞(antigen stimulated B lymphoblast)融合得到杂交瘤细胞(hybridoma cell)，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术(hybridoma technology）Niels K.Jerne,G.Kohler,C.Milstein,免疫网络学说,单克隆抗体：1984 Nobel,二、杂交瘤技术的基本原理,三、杂交瘤细胞的制备,（一）骨髓瘤细胞选择及选择性培养基,骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体,选择次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（,HGPRT-,）,胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（,TK-,）,HAT培养基,次黄嘌呤（hypoxanthine，H）,氨基喋呤（aminopterin，A）,胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidine，T）,次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）,胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）,（二）免疫小鼠,免疫程序是取68周龄BalbC雌鼠，基础免疫2周，静脉再加强免疫一次，35天后用于融合。
免疫时是否采用佐剂和事先处理抗原，要依抗原性的强弱而定一般来讲可溶性抗原用完全佐剂效果较好抗原量同样与抗原强弱有关，以IgG为例，第一次为l00,g，,第二次为50,g,，免疫途径第一次可经腹腔注射对于细胞性抗原不用佐剂，每次腹腔注射1l0,6,一110,7,三）脾细胞的制备,(1)引颈处死小鼠，用酒精消毒体表；,(2)无菌条件下取出脾脏，剃除结缔组织和脂肪，用5ml无血清培养液冲洗一次；,(3)把脾脏置于已消毒的90一100目不锈钢网或尼龙纱网中；,(4)在脾中部切开一小口，用注射器芯从一端轻轻压挤，再用无血清培养液冲洗，令细胞通过纱网，收集入平皿中，或用注射器向脾脏内注入3ml无血清培养液，反复抽吸数次方法获取细胞，再制成细胞悬液亦可；,(5)把细胞悬液注入50ml离心管中，加l0一20ml培养液：轻轻吹打数次，室温中置5分钟；,(6)离心(800一1000转分)计数、备用四）细胞准备,（1）收集骨髓瘤细胞，用无血清培养液洗3次(37)，计数活力细胞(不少于90)；,（2）收集小鼠脾细胞，用无血清培养液洗3次(37)，并计细胞数和测定活力细胞；,（3）按1：5或1：10混合脾细胞和骨髓瘤细胞后，离心弃去上清，并以消毒滤纸吸净多余上清。
五）细胞融合,(1)将1ml 40的PEG液一滴滴加入列细胞团中，在6。