miRNA常用实验措施一、 miRNＡ的检测措施ｍiRNA的rｅaltime-PＣＲ检测措施1、 ｒealtime-PCＲ引物设计miRＮA reａｌtimｅ-PＣR引物设计措施：１）ｓｔｅm-lｏop ＲT引物设计：基于通用的茎环构造,只需要按照不同的miRNA序列修改最末端6个碱基即可通用茎环构造序列为:GＴＣGTATＣCAGTＧCＡＧGＧTCＣGAGＧＴATTCＧCACTGGATAＣGAC例如设计miR－1（ＵGGAAUGUAAAGＡAGUAUGUＡＵ）的RT引物，只需在通用茎环序列后架上ｍiＲＮA３’末端的6个碱基的反向互补序列，即ＧTCＧTＡTCCAGＴGCAGGGTCＣGAGＧＴATTCGＣＡCTGGAＴAＣGACATAＣＡT2）reａｌtiｍe 上游引物设计：mｉＲNA序列除去3’端6个碱基的剩余部分作为上游引物,如miR-1的上游引物为（注意把U改为T)：TGGAATGTＡAＡGAAGＴ.检查引物的Tm值(一般参照DNAＭAN），如果Ｔｍ值较低,则在5’端加GＣ使Tｍ值接近60度因此miＲ-１的上游引物可设计为:GCGCＴＧGAATGTAAAGAＡＧT,６1．4度３)下游引物是通用的，序列为GTＧCAGGGTCCＧＡGGＴ。
4）引物设计好后，需要通过预实验检测引物的特异性一般需要做溶解曲线来检测引物的特异性;同步最佳将ＰCR产物进行电泳检测产物与否单一(因产物长度很小，需要3％以上的琼脂糖胶）2、 miＲNA反转录ｍiRNＡ的反转录与一般基因的反转录过程基本相似由于其产物很短,用最一般的逆转录酶即可我们一般使用的是TIANGEN的MLV，逆转录体系为:RNA 500nｇ～2ｕg5ｘbufｆeｒ ２uｌｄNTＰ 0.25ｕlDDT ０.25ulRＲI 0.２５ｕlMLV 0.25ｕlRＴ prｉｍer 0.5ulH２O(RNase free） 补至10ｕl程序为（PCR仪中一般命名为CTＦRT）16度，30mｉn;42度,６０min；８5度,5min；４度,holｄ做mｉRNＡ的反转录时,注意不要忘掉内参的ＲT,即一种样品至少要做目的mｉRＮＡ和内参两管反转录反映3、 realtimｅ-PＣR实验miRNA逆转录完毕后得到的cDNA即可进行下一步PCR。
在确认引物的特异性后,我们可以进行正式实验一般每个样品至少需要3个平行孔Realtｉme PCR体系为（ABＩ定量PＣＲ仪 需要加ＲOX ｄye ＩI， Bｉoraｄ 定量PCＲ仪不需要加ＲOX)：2X SYBR 1０ ulROX II 0.4ul (Bioｒaｄ 不加）Ｐrimｅr 1ul Tｅｍplate 1ｕlH2O 7.6uｌ （Bioraｄ ８uｌ）需要注意的几点：1)在配制PCR体系时，请一定配制总体系,逐渐分装每步分装前充足混匀这一点是ＰＣR平行性的保证２）配制体系尽量在冰上进行3)请选用比较精确的枪进行体系配制,并注意体系的冗余一般来说,配制一整个９6孔板的PＣR体系,我会配制１0０个反映的总量，保证分装到最后稍有剩余ＰCR 程序:95度，1miｎ;95度，５s;60度,３4ｓ(此步在读取荧光值）40到45个循环4、realtimｅ PCR成果分析reaｌｔime PCR反映结束后返回Ct值,可以运用定量PCR仪软件自带的程序进行分析,也可以运用EＸCEL表格进行相对定量计算具体的计算措施：将三个平行孔的数值拷入到ＥXCＥL表格的相应位置,即可自动计算出相对值。
注意，第一组样品的值将被默觉得归一为1其她的样品与之相比得出相对值EXCEL表格公式见附件二、 miRＮA靶基因的预测mｉＲNA靶基因预测软件简介1、 TaｒｇｅtScan：一方面选择预测的物种，如果要预测小鼠的miRNA和靶基因，则点击右上角的“Gｏ to TａrgｅｔSｃanＭｏusｅ”第二个选项可输入基因名(有时不辨认别名)，点击submit即可，此操作可预测也许靶向该靶基因的miRNA;或者输入mｉＲNA的名字，点击submｉｔ,此操作可以预测该miRNA的靶基因2、 Pｉｃtar：输入网址后进入picｔar主页，下面有几种可选用的数据库,一般选用最后两个数据库即可点击进入预测界面选择物种，选择要预测的miRＮA（注意：如果你感爱好的ｍiRNA在下拉菜单中未列出，则不可预测，可考虑换用其她软件)并点击ｓｅａrｃh for tａrｇｅtｓ of a miＲNA或输入gene IＤ（注意:与taｒgetscan不同，piｃtａｒ一般不辨认基因名,最佳输入ｇｅne号：NM_****＊)点击ｓearｃｈ for ａｌｌ mｉRNＡs prediｃtｅd ｔo target a ｇｅnｅ.进行预测。
3、 Mｉrｂasｅ： 分别输入mｉＲＮA名或基因名即可进行预测其她选项不用更改预测成果的解决和分析我们一般会将三种不同软件的分析成果做比较,选用两种以上软件预测的交集部分作为我们候选的靶基因如果这样的成果仍然过多，可以选用三种软件预测的交集进行下一步筛选如果三种软件预测的成果没有交集部分，可以取并集,然后从中按功能提示进行挑选三、 miRNA的过体现和敲低1、 过体现过体现miRNA一般可采用两种措施：a 构建过体现载体；b 人工合成成熟ｍiRNAa 构建过体现载体１)获取mｉRNA基因的序列及旁侧序列 进入Ensｅｍbｌ()主页输入ｍiＲNA名，点击进入在eｘport datａ页面上选择输入5’fｌanｋing sｅquｅnｃｅ和3’flanking ｓｅquenｃe 分别为20０bp（见下图）,然后点击ｎeｘｔ即可得到涉及前体和左右侧翼200bp的序列２)基于这段序列,我们可以设计该ｍiＲNA的体现序列引物设计原则:扩增产物涉及前体,并左右各有至少７０bｐ的侧翼序列，长度一般在２00ｂp-５00bp其她同一般引物设计载体可以选用任意使用RNA ｐｏlＩＩ辨认的启动子的载体，涉及T7，CＭV等。
常用的是pcDNA3.1,不要带标签的注意:如果miＲNＡ位于ｃluｓter中,则扩增长度要控制，避免同步涉及两个或两个以上的ｍiRNA完毕体现载体的克隆并测序确认后，转入到细胞中进行体现检测如果目的miRNA的体现明确，则载体构建完毕b 合成成熟的miＲNA序列 查出ｍiRＮA的精确序列,请公司合成成熟的序列常用的公司有:上海吉凯;inｖｉtrogeｎ等2、 敲低目前做内源性miRNA的敲低一般使用人工合成的ｍiＲNA的反义链，即成熟miRＮA的序列的反义互补序列如miｒ-x 序列为 ＵCＡCACAACCCACＣACＣAUＵG，则其inhibitor 序列为CAAUＧGＵＧGUGGGＵUGUＧUGA. 将该序列送交公司合成即可报告基因实验措施一、 miＲＮA靶基因筛选荧光素酶报告基因实验1、荧光素酶报告基因质粒的构建载体质粒为通过改造的pcDＮＡ3.1,其图谱见下图可用的酶切位点为ＮoｔI,XｈoＩ及XbaI． 推荐优先使用XｈoＩ和XbaI两个酶切位点如过不能用，可用NotI.3’UTR of TargetsXhoIXbaI靶基因３’UTR的获得3’UTR序列是指从Ｍrnａz终结密码子后的第一种碱基开始到mRNA最后一种碱基(一般是poｌyA结尾)。
模板可采用相应物种的cＤＮA或基因组在选择模板时要注意:一般来讲，ｃDNA适于所有的3’ＵTＲ扩增，但有时3’端AT过多导致引物设计困难时,可以考虑用基因组做模板但是基因组做模板的前提是靶基因３’UTR由一种外显子构成有关信息可以从enseｍbｌ中查阅外显子信息可以懂得一般尽量全面的扩增３’ＵTＲ,但如果３’UTR过长或引物设计困难,可以选用涉及miＲNA结合位点的一段３’UTR引物设计的原则同一般引物设计2、荧光素酶实验构建好荧光素酶报告基因实验后，准备开始做报告基因实验前,你还需要准备如下材料：1）TK质粒,作为共转染的内参２）mｉＲＮA的过体现质粒或合成的miＲNA质粒的浓度尽量在50０ng/ul以上，合成的miRNA稀释到２０uM3)状态良好的细胞1） 分细胞我们常用24孔板进行报告基因实验分细胞时保证细胞铺板均匀（摇匀细胞的措施见细胞培养的措施）,每孔细胞数目相称以293ET细胞为例，我们转染的密度一般在６０-８0％作用，如果用威格拉斯转染试剂，细胞密度可以稍高些，由于转染后细胞死亡较多2） 转染转染时必须配总体系再依次提成小体系这一步决定着每个孔的平行性和实验的可反复性转染核酸用量为每孔：ｌuｃ-3’UTR 2０0ｎg;TＫ ５0ng；mｉRＮA-ｐcDNA3.1 １ug或合成的ｍｉRＮＡ 2.5ul（终浓度100nM)。
Vig每孔用量为1ul，lip为2uｌ转染后4-6h换液如果用vig转染必须及时换液,否则细胞会尸横遍野注意设立合理的对照，一般用ｐcDNA３.1（或miRNA ＮC）替代miRNA-pcDＮA3.１(ｍiＲＮA)做mｉRNＡ的对照3） 收细胞转染２4-４8h可以收取细胞用生理盐水或PＢS清洗细胞两次,因2９３细胞极易脱落，建议操作温柔，如果对自己的操作没有自信,可以增大生理盐水量只洗一次之后吸干生理盐水每孔加入80ｕl 1Xｐassｉｖe buｆfeｒ(裂解液的量可视细胞数目稍作调节)，室温摇20ｍiｎ,如果细胞裂解充足会看到白色粘稠状细胞碎片如果不立即测，可连同24孔板冻于-80度，测时再取出解冻２0度可保存一周4度可保存一天4） 测定荧光素酶活性使用中心实验室１０8室turner仪器进行双荧光素酶的测量具体仪器操作措施可学习有关教程或请教师兄师姐我们使用的试剂盒为proｍega的双荧光素酶报告系统:bｕffeｒＩI为萤火虫荧光素酶的底物,测量数值为我们的报告基因的活性；S&G ｂｕffer 作用是淬灭萤火虫荧光素酶的活性并提供海肾荧光素酶反映的缓冲环境,测定的数值为内参的活性测定期，取细胞裂解液8ｕl到９6孔板中（专用的96孔板）上机测量。
每种底物每孔加3０uｌ３、成果分析测定荧光素酶后会返回三个值:萤火虫荧光素酶活性、海肾荧光素酶活性及两者的比值比值将作为最后的分析数据,反映了该孔报告基因的相对活性一般将对照归一为1,实验组与其相比取相对值此相对值用于最后作图和记录分析归一措施和作图请自学ＥXCEL或请教其她同窗GＦＰ报告基因实验1、 GFP报告基因质粒构建:与荧光素酶报告基因质粒构建措施同仅仅是用GFP取代lucifeｒaｓｅ2、 实验措施及成果分析1） 转染一般使用12孔板进行实验,每孔转染量:GＦP-３’UTR，２00ng－５00ｎｇ；mｉRNA，1ｕg 质粒或1０0nM 合成的miRＮA2） 转染48h后，用荧光显微镜照相，观测绿色荧光的强度；收取细胞,用GFP抗体检测GFＰ体现水平建议做三个平行孔,成果需要进行记录学分析以判断差别与否明显二、 转录因子调控分析1、 启动子的预测、确认启动子是指RNA聚合酶辨认并结合的DNA序列，并涉及增进这一过程的调节蛋白的结合位点启动子位于转录起始位点。