第九章 分子杂交技术互补的核苷酸序列通过 Walson-Crick 碱基配对形成稳定的杂合双链分子 DNA 分子的过程称为杂交 杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸该检测对象可以是克隆化的基因组DNA，也可以是细胞总D NA或总RNA根据使用的方法被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交，即细胞原位杂交探 针必须经过标记，以便示踪和检测使用最普遍的探针标记物是同位素， 但由于同位素的安全性，近年来 发展了许多非同位素标记探针的方法核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性，因而该技术在分子生物学领域中已广泛地使用于克 隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面因而它 不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用，而且在临床诊断上的应用也日趋增多第一节 核酸探针标记的方法核酸探针根据核酸的性质，可分为DNA和RNA探针;根据是否使用放射性标记物的与否，可分为放射 性标记探针和非放射性标记探针;根据是否存在互补链，可分为单链和双链探针;根据放射性标记物掺入情况， 可分为均匀标记和末端标记探针。
下面将介绍各种类型的探针及标记方法一、双链DNA探针及其标记方法分子生物研究中，最常用的探针即为双链DNA探针，它广泛应用于基因的鉴定、临床诊断等方面 双链DNA探针的合成方法主要有下列两种:切口平移法和随机引物合成法1.切口平移法(nick translation)当双链dna分子的一条链上产生切口时,E.coii dna聚合酶I 就可将核苷酸连接到切口的3'羟基末端同时该酶具有从5'—3'的核酸外切酶活性，能从切口的5'端除去核 苷酸由于在切去核苷酸的同时又在切口的3'端补上核苷酸，从而使切口沿着DNA链移动，用放射性核苷酸 代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中最合适的切口平移片段一般为50-500个 核苷酸切口平移反应受几种因素的影响：(a)产物的比活性取决于[a-32 P]dNTP的比活性和模板中核苷 酸被置换的程度b) DNA酶I的用量和E.coli DNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小c) DNA模板 中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性， 故应使用仔细纯化后的 DNA材料： 待标记的 DNA设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等试剂：(1) 1OX切口平移缓冲液:0.5mol/L Tris • Cl (pH7.2); O.lmol/L MgSO4 ; 10mmol/L DTT; lOOp g/ml B SA。
2) 未标记的dNTP原液:除同位素标记的脱氧三磷酸核苷酸外，其余3种分别溶解于50mmol/L Tris O (pH7.5)溶液中,浓度为0.3mmol/L3) [a -32 P] dCTP 或[a -32 P]dATP:400 Ci/mmol, 10p Ci/p l4) E.coli DNA 聚合酶 I (4 单位/p l):溶于 50p g/ml BSA, 1mmol/L DTT, 50%甘油，50mmol/L Tri s • Cl(pH7.5)中5) DNA 酶 I :1mg/ml6) EDTA :200mmol/L (pH8.0)7) 10mol/L NH4Ac操作步骤:(1) 按下列配比混合:未标记的 dNTP 10p l10X切口平移缓冲液5p l待标记的 DNA 1p g[a -32 P]dCTP 或 dATP(70p Ci) 7p lE.coli DNA聚合酶4单位DAN 酶 I lp l加水至终体积50p l(2) 置于15 °C水浴60分钟3) 加入5p l EDTA终止反应4) 反应液中加入醋酸铵，使终浓度为O.5mol/L,加入两倍体积预冷无水乙醇沉淀回收DNA探针。
［注意］1、3H, 32P及35S标记的dNTP都可使用于探针标记，但通常使用［a -32 P］-dNTP2、DNA酶I的活性不同，所得到的探针比活性也不同，DNA酶I活性高，则所得探针比活性 高，但长度比较短2.随机引物合成法随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合，在Klenow酶的作 用下，合成DNA探针合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量通常， 产物平均长度为400-600个核苷酸利用随机引物进行反应的优点是：(1)Klenow片段没有5'-3'外切酶活 性，反应稳定，可以获得大量的有效探针2)反应时对模板的要求不严格，用微量制备的质粒DNA模板也可进 行反应3)反应产物的比活性较高，可达4X109 cpm/p g探针4)随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中 直接进行材料：待标记的DNA片段设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等试剂：(1) 随机引物(随机六聚体或断裂的鲑鱼精子 DNA)2) 10X 随机标记缓冲液：900mmol/L HEPES (pH6.6); 10mmol/L MgCl23) Klenow 片段4) 20mmol/L DTT。
5)未标记的dNTP溶液：dGTP、dCTP和dTTP溶液，各5mmol/L6) [a -32 P] dATP:比活性＞3000Ci/mmol, 10p Ci/p 17) 缓冲液 A： 50mmo1/L Tris • Cl (pH7.5) ; 50mmo1/L NaCl; 5mmo1/L EDTA (pH8.0) ; 0.5% SD S操作步骤 :(1) 200ng双链DNA(1m l)和7.5ng随机引物(1p l)混合后置于eppendorf管内，水浴煮沸5分钟后，立即 置于冰浴中 1 分钟2) 与此同时，尽快在一置于冰浴中的0.5ml eppendorf管内混合下列化合物：20mmol/L DTT 1p l未标记的dNTP溶液1M l10 X随机标记缓冲液1m l[a -32 P] dATP(比活性＞3000Ci/mmol; 10p Ci/p l) 3p lddH2O 1M l(3) 将步骤(1)eppendorf管中的溶液移到步骤(2)管中4) 加入5单位(约1M l) Klenow片段，充分混合，在微型离心机中以12000g离心1-2秒，使所有溶液沉 于试管底部，在室温下保温3-16小时。
5) 在反应液中加入10m l缓冲液A后，将放射性标记的探针保存在-20°C下备用同时计算放射比活性[注意]1、引物与模板的比例应仔细调整，当引物高于模板时，反应产物比较短，但产物的累积较多；反之， 则可获得较长片段的探针2、模板DNA应是线性的，如为超螺旋DNA，则标记效率不足50%二、单链 DNA 探针用双链探针杂交检测另一个远缘DNA时，探针序列与被检测序列间有很多错配而两条探针互补链之 间的配对却十分稳定,即形成自身的无效杂交,结果使检测效率下降采用单链探针则可解决这一问题单链 DNA探针的合成方法主要有下列两种:(1)以M13载体衍生序列为模板，用Klenow片段合成单链探针；(2) 以RNA为模板，用反转录酶合成单链cDNA探针1.从M13载体衍生序列合成单链DNA探针合成单链DNA探针可将模板序列克隆到噬粒或 M13噬菌体载体中，以此为模板，以特定的通用引物或以人工合成的寡合苷酸为引物，在[a-32P]-dNTP的存在 下，由Klenow片段作用合成放射标记探针，反应完毕后得到部分双链分子在克隆序列内或下游用限制性 内切酶切割这些长短不一的产物，然后通过变性凝胶电泳(如变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)将探针与模板分离 开。
双链RF型M13 DNA也可用于单链DNA的制备，选用适当的引物即可制备正链或负链单链探针材料：已制备好的单链DNA模板(方法参见第十章中有关内容)设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等试剂：(1) 10X Klenow 缓冲液：0.5mol/L NaCl, 0.1mol/L Tris • Cl(pH7.5); 0.1mol/L MgCl22) 0.1mol/L DTT 溶液3) [a -32 P] dATP： 3000Ci/mmol, 10p Ci/p l4) 40mmol/L 和 20mmol/L 的未标记的 dNTP 溶液5) dCTP，dTTP，dGTP 各 20mmol/L 的溶液6) Klenow 片段(5 单位 /ml)7) 适宜的限制酶，如EcoRl、Hindlll等8) 0.5mol/L EDTA ( pH8.0)操作步骤：(1)在 0.5ml eppendorf 管中混合如下溶液：单链模板(约 0.5pmol) 1mg适当引物 5pmol10 X Klenow 缓冲液 3ml加水至 20ml⑵将eppendorf管加热到85°C 5分钟，在30分钟内，使小离心管降到37°C；(3) 依次加入：DTT 2ml[a-32P]dATP 5ml未标记的 dATP 1mldGTP,dCTP,dTTP 混合液 1ml混合均匀后，稍离心使之沉于试管底部。
4) 加1ml(5单位)Klenow酶室温下30分钟5) 加 1ml20mmol/L未标记的dATP溶液20分钟⑹68C加热10分钟，使Klenow片段失活调整NaCl浓度，使之适宜于酶切7)加入20单位限制性内切酶(如EcoR I , Hindlll等)酶切1小时⑻酚/氯仿抽提DNA，乙醇沉淀以去除dNTP或加0.5mol/L EDTA(pH8.0)至终浓度10mmol/L9)用电泳方法分离放射性标记的探针2.从RNA合成单链CDNA探针cDNA单链探针主要用来分离cDNA文库中相应的基因用R NA为模板合成cDNA探针所用的引物有两种：(1)用寡聚dT为引物合成cDNA探针本方法只能用于带P oly(A)的mRNA，并且产生的探针极大多数偏向于mRNA 3'末端序列2)可用随机引物合成cDNA探针 该法可避免上述缺点，产生比活性较高的探针但由于模板RNA中通常含有多种不同的RNA分子,所得探 针的序列往往比以克隆DNA为模板所得的探针复杂得多，应预先尽量富集mRNA中的目的序列反转录得到的产物RNA/DNA杂交双链经碱变性后,RNA单链可被迅速地降解成小片段，经Sephadex G -50柱层析即可得到单链探针。
材料：已提纯的RNA或mRNA设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等试剂：(1) 合适的引物：随机引物或oligo(dT)15-182) 5mmol/L dGTP， dATP dCTP， dTTP3) [a-32P]dCTP(>3000Ci/mmol， 10mCi/ml)4) 反转录酶(200000单位/ml)5) 100mmol/L DTT6) 250mmol/L MgCl27) 1mol/L KCl8) 0.5mol/L EDTA (pH8.0)9) 10% SDS10) RNasin(40 单位/ml)操作步骤：(1) 在已置于冰浴中的灭菌离心管中加入下列试剂：RNA 或 mRNA 10.0ml合适的产物(lmg/ml) 10.0mllmol/L Tris • Cl(pH7.6) 2.5ml1mol/L KCl 3.5ml250mmol/L MgCl2 2.0ml5mmol/L dNTP 10.0ml[a-32P]d。