1神经元型一氧化氮合酶在快速衰老小鼠海马中的增龄性改变作者：张立红， 任天华， 方马荣， 姚大卫， 王铭维【摘要】 【目的】 通过观察快速衰老小鼠(SAM)在衰老过程中海马中 nNOS的分布和表达变化，探讨 NO/nNOS 在中枢神经系统衰老中的作用 【方法】采用雄性快速衰老亚系 8 小鼠(SAMP8)及抗快速衰老亚系 1 小鼠(SAMR1)为研究对象，其中 SAMP8 为实验组，SAMR1 为对照组，每组动物再分为青年组（2 月龄）和老年组（10 月龄）两组，每个年龄组随机分配 6 只动物用免疫组织化学法标记SAM 海马中 nNOS 神经元，观察海马 CA1，CA2 和 CA3 区 nNOS 神经元的形态和分布，并计数 nNOS 神经元的数量；用 RT-PCR 法检测海马中 nNOS mRNA 表达水平（用平均灰度值表示） 【结果】老龄 SAMP8 海马中阳性神经元的形态与其它组比较无明显差别，但 CA1 和 CA2 区阳性神经元密度明显减低，CA3 区阳性神经元密度无明显改变SAMP8 老年组与青年组相比，海马 CA1 和 CA2 区 nNOS 阳性细胞的数量显著减少(73±14 vs 144±38, P< 0.01; 71±30 vs 126±39, P< 0.05)，CA3 区阳性神经元数量无显著差别；SAMP8 与 SAMR1 比较，青年组海马nNOS 阳性细胞的数量无显著差别，老年组海马 CA1 和 CA2 区阳性细胞的数量显著减少(73±14 vs 139±24, P< 0.01; 71±30 vs 120±37, P< 0.05)。
SAMP8 老年组海马 nNOS mRNA 水平明显低于青年组(0.43±0.17 vs 0.92±0.15, P< 0.01)，且低于相应月龄 SAMR1(0.43±0.17 vs 0.86±0.13, P< 0.01)结论】海马中 nNOS 催化产生不足量 NO 可能加速 SAMP8 衰老，致使学习记忆能力下降，为通过调节 NO 产量来延缓衰老及衰老相关学习记忆能力下降提供了理论依据 【关键词】 神经元型一氧化氮合酶； 一氧化氮； 衰老； 快速衰老小鼠； 海马一氧化氮(nitric oxide, NO)在中枢神经系统中是一种兼具细胞间、细胞内信使和神经递质作用的信息分子，在机体内发挥着极其重要的生理和病理作用[1]随着对 NO 不断深入的研究，发现其与中枢神经系统衰老关系密切，已成为神经病学和神经生物学研究的热点之一[2]一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)是 NO 生物合成的关键酶[3]，不同的 NOS 催化合成的 NO 在不同的组织细胞中发挥着不同的生物学效应，神经元型 NOS(neuronal NOS, nNOS)产生的 NO 在学习记忆机制中起重要作用[4]。
海马是与学习记忆功能最密切的脑区之一[5]由于 NO 的半衰期很短，高度活跃，极不稳定，直接检测尚存在技术上的困难，因此多采用检测 NOS 的间接方法来反映组织细胞中的 NO 含量目前，该领域的研究多采用正常衰老的动物为研究对象，而且研究结果不一致快速衰老亚系 8 小鼠(senescence accelerated mouse/prone 8, SAMP8) [6]是目前研究衰老及衰老相关学习记忆功能障碍的良好的哺乳类动物模型，但是，有关nNOS 在 SAMP8 海马中增龄性改变的研究，在国内外尚未见报道本实验通过观2察 SAMP8 在衰老过程中海马中 nNOS 的分布和表达变化，探讨 NO/nNOS 在中枢神经系统衰老以及衰老相关学习记忆障碍中的作用及意义1 材料与方法1.1 实验动物与分组采用雄性 SAMP8 和抗快速衰老亚系 1 小鼠 (senescence accelerated mouse/resistance 1，SAMR1)为研究对象(由香港中文大学实验动物中心提供)，其中 SAMP8 为实验组，SAMR1 为对照组，每组动物再分为青年组 (2 月龄)和老年组(10 月龄)两组，每个年龄组随机分配 6 只动物。
饲养环境：动物饲养于无特异病源菌房间，昼夜循环周期为 12 h∶12 h（6:00 开灯，18:00 关灯） ，自由饮水饮食，温度(20±1)℃1.2 实验试剂与器材nNOS 多克隆抗体（一抗）购自 Santa Cruz 公司；驴抗兔 FITC 荧光抗体，激发光波长为 488 nm（二抗）购自 Molecular probes 公司；Trizol、cDNA 合成试剂盒、PCR 试剂盒、10×上样缓冲液、100 bp DNA ladder 等试剂均购自Invitrogen 公司；氯仿、异丙醇、乙醇等均购自 Sigma 公司As620E 恒温冷冻切片机由美国 Shandon 公司制造；MRC1024 激光共聚焦显微镜和 mini-sub cell GT 电泳仪由 BIO-RAD 公司制造；Axiophot2 荧光显微镜由 Zeiss 公司制造；Biophotometer 分光光度仪由 Eppendorf 公司制造；GeneAmp2400PCR 仪由美国Perkin Elmer 公司制造；凝胶成像系统及 Fluorchem 1.02a 分析软件由美国ALPHA Innotech 公司制造1.3 免疫组织化学法检测 nNOS 在 SAMP8 和 SAMR1 海马中的分布和表达SAM 经腹腔注射 70 g/L 水合氯醛（350 mg/kg）麻醉后，再经升主动脉快速灌注 8.5 g/L 生理盐水约 50 mL，继之灌注 40 g/L 多聚甲醛磷酸缓冲液(0.1 mol/L, pH=7.4)约 200 mL。
将脑取出，后固定于 40 g/L 多聚甲醛磷酸缓冲液中，4 ℃，4 h，然后将组织移入含 100 g/L 蔗糖 0.1 mol/L 磷酸缓冲液 1 h (pH=7.4, 4℃)，再入 250 g/L 蔗糖磷酸缓冲液中约 24~48 h，至组织下沉， OCT 复合物包埋，放入液氮冷却的异戊烷中冷冻冷冻包块在海马部位作冰冻连续冠状切片，核团定位参照 George Paxinos 等的图谱[7]切片厚 40 ?滋 m，间隔 3 片取 2 片，用免疫荧光标记法进行漂染，步骤如下：(1)孵育切片于包含 3 mL/L TritonX-100 和 50 mL/L 正常驴血清的 PBS 缓冲液中，30 min，去除上述阻断液（不要漂洗） ；(2)孵育切片于一抗溶液中（稀释度为 1 ∶ 500）室温下过夜；(3)孵育切片于二抗溶液中（稀释度为 1∶600）室温下 2 h；(4)以上各步骤间均用 0.01 mol/L 的 PBS 缓冲液漂洗 3 次，每次 5 min；(5)常规裱片，封片；(6)在普通荧光显微镜下观察（激发光为 470 nm，释放光为 520 nm，黄绿色荧光），人工计数阳性细胞数，激光共聚焦显微镜拍照，所有分析由一个对实验分组不知情者完成。
阴性对照用 PBS 缓冲液代替一抗31.4 RT-PCR 法检测海马 nNOS mRNA 的水平小鼠经颈椎脱位处死后，立即打开颅骨充分暴露脑部，将两侧海马完整取出，冷冻于-80 ℃冰箱中按 Trizol 法提取总 mRNA，然后逆转录合成 cDNA：即50 ?滋 mol/L oligo(dT)12~18 1.0 ?滋 L，10 mmol/L dNTP mix 1.0 ?滋L，RNA 2.0 ?滋 g，总体积 13.0 ?滋 L，将此溶液在 65 ℃孵育 5 min 后立即置冰上冷却至少 1 min，然后分别加入以下溶液：5 × first strand buffer 4.0 ?滋L，0.1 mol/L DTT 1.0 ?滋 L，RNA 酶抑制剂 1.0 ?滋 L，SuperScriptⅢ逆转录酶（200 U/?滋 L）1.0 ?滋 L，将以上成分混匀，50 ℃孵育 60 min，然后 70 ℃加热 15 min 终止反应最后进行 PCR 反应：10 × PCR buffer 2.5 ?滋 L，50 mmol/L MgCl 0.75 ?滋 L，10 mmol/L dNTP 0.5 ?滋 L，待测基因的上下游引物均为 0.5 ?滋 L，DEPC H2O 19.05 ?滋 L，cDNA 1.0 ?滋 L，Taq DNA 聚合酶(5 U/?滋 L) 0.2 ?滋 L，总体积 25.0 ?滋 L。
反应条件：94 ℃，5 min，然后 94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，30 个循环,全部周期结束后于72 ℃延伸 5 min每个样本重复至少 2 次PCR 反应后，取 10 ?滋 L PCR 产物在 2%琼脂糖凝胶上电泳(含 EB，终浓度 0.5 ?滋 g/mL)30 min,电压 100 V，用凝胶成像系统拍照观察，用 Fluorchem 1.02a 软件对条带的灰度进行分析将实验组和对照组条带的平均灰度值与相应的 β-actin 条带的平均灰度值的比值进行比较从基因库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中查出小鼠 nNOS 及 β-actin 的 cDNA 全序列，用 Primer3 引物设计软件设计其特异性 PCR 引物，由Invitrogen 公司合成nNOS 上游引物 5′-CCA GCT CTT CCC TCT AGC-3′，下游引物 5′-CTT TGT TGG TGG CGT ACT-3′，产物大小为 302 bp1.5 统计学分析数据用均数±标准(ｘ±ｓ)差表示，采用方差分析进行统计比较，P< 0.05 被认为差异有统计学意义，应用 SPSS11.0 软件完成。
2 结 果2.1 海马内 nNOS 阳性神经元的形态和分布变化多形细胞层和分子层有少量阳性神经元散在分布，锥体细胞层多数神经元呈阳性标记阳性细胞大小不等，着色深浅不一，大多为卵圆形或圆形老年组SAMP8 的 CA1 和 CA2 区阳性神经元的形态与其它组比较无明显差别，但分布密度和强度明显减低（图 1、2，见封 2） ；CA3 区阳性神经元的形态和分布与其它组比较均无明显差别2.2 海马内 nNOS 免疫阳性神经元的数目变化SAMP8 老年组（10 月龄）与青年组（2 月龄）相比，海马 CA1 区阳性细胞的数量减少非常显著，海马 CA2 区阳性细胞的数量显著减少；CA3 区阳性神经元数量无显著差别；SAMP8 与 SAMR1 比较，青年组海马 CA1 和 CA2 区阳性细胞的数量无显著差别，老年组阳性细胞的数量显著减少，CA3 区两组阳性细胞的数量均4无显著差别(表 1)2.3 SAMP8 海马中 nNOS mRNA 表达水平老年 SAMP8 海马 nNOS mRNA 水平（用平均灰度值表示）明显低于青年组SAMP8，且低于相应月龄对照组 SAMR1（图 3，表 2） 3 讨 论3.1 目前对于衰老动物模型的研究现状目前在衰老的研究中，多以正常老化动物为模型，其缺点不仅有饲养时间长、价格昂贵等不足，而且正常衰老的动物多不伴有典型的病理特征，因此作为研究衰老相关性疾病的模型具有一定的局限性。
SAM 是目前研究快速衰老的良好的哺乳类动物模型[6]，分为 SAMP 及 SAMR 亚系，每一亚系又根据病理改变不同分为不同表现型，SAMP8[8]主要以学习记忆功能呈增龄性加速衰退、中枢神经系统如皮层、海马等部位发生与人类相似的病理学改变为主此外，小鼠遗传信息非常丰富，与人类遗传学特征非常相似SAMP8 在 2 月龄就开始出现学习记忆功能衰退，并随增龄而加重，表现为空间学习记忆能力下降因此，SAMP8 为探讨中枢神经系统衰老及衰老相关学习记忆功能障碍的发生机制提供了良好的动物模型有关 nNOS 在 SAMP8 海马中增龄性改变的研究，在国内外尚未见报道 3.2 本实验 nNOS 在 SAMP8 和 SAMR1 海。