菌种的培养1.1材料1.1.1 菌种枯草芽孢杆菌1.1.2 培养基(1) LB培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g , NaCIIOg，蒸馏水1000ml ,pH为7, (可溶性淀粉20g)琼脂20g2 )筛选用培养基：含有2%可溶性淀粉的LB培养基3) 种子培养基：豆饼粉 4%，玉米粉 3%，Na2HPO40.8%，(NH4)2SO40.4%， NH4Cl0.15%，H2O 4 )发酵培养基：豆饼粉5.6% ，玉米粉7.2% ， Na2HPO40.8% ， (NH4)2SO40.4% ，NH4CI0.13% , CaCI20.13% ,a—淀粉酶 50g2】1.1.3 主要试剂蔗糖、葡萄糖、淀粉、玉米淀粉、麦芽糖、酵母浸出物、胰蛋白胨、牛肉膏、尿素、 氯化铵、硫酸锰、硫酸镁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸亚铁、氯化钠和氯化钙1.1.4 仪器设备控温摇床、高压蒸气灭菌锅、电子天平、pH测定仪、无菌操作台和紫外分光光度计1.2方法1.2.1 培养基的制备(1) 称量按培养基配比依次准确地称取酵母膏、NaCI、蛋白胨放入烧杯中，并在烧杯中加入 少量蒸馏水注：酵母膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒 入烧杯，也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，酵母膏便会与称 量纸分离，然后立即取出纸片【3】。
2) 溶化可溶性淀粉溶液的配制方法：将所需克数的可溶性淀粉放入一个小烧杯中，加入少 量蒸馏水，搅拌成糊状，然后将糊状溶液均匀倒入少于培养基总体积的沸水中，一边搅 拌一边加热，待其溶化成透明状后继续在电炉上加热 5 分即制成可溶性淀粉溶液如果配制固体培养基时，将已准备好的可溶性淀粉溶液倒入烧杯中，将称好的琼脂 放入已溶的药品中，再加热溶化，补水到所需的总体积在制备用三角瓶盛固体培养基 时，一般也可先将一定量的液体培养基分装于三角瓶中，然后按2%的量将琼脂直接分 别加入各三角瓶中，不必加热溶化，而是灭菌和加热溶化同步进行，节省时间【4】在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器同时，需不断搅 拌，以防琼脂糊底烧焦配制培养基时，不能用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养 基中，影响细菌生长3) 调 pH培养基配好以后，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向 培养基中逐滴加1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直到pH达 7为止；反之，用1mol/LHCl进行调节对于有些要求pH较精细的微生物，其pH的调节可用酸度计进行⑸注意：pH不要调过头，以避免回调而影响培养基内各离子的浓度，配制pH低的 琼脂培养基时，若预先调好pH并在高压蒸汽下灭菌，则琼脂因水解不能凝固，因此应 将培养基的成分和琼脂分开灭菌后再混合，或在中性pH条件下灭菌，再调整pH。
4) 分装按照实验要求，可将配置的培养基分装入试管内或三角瓶中 液体分装：分装的高度以试管高度的1/4左右为宜；分装三角瓶的量则根据需要而 定，一般以不超过三角瓶的一半为宜固体分装：分装于试管中的应不超过试管的1/5 ，灭菌后制成斜面；分装三角瓶的 量以不超过一半为宜5) 加塞培养基分装完毕后，在试管口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成 污染，并保证有良好的通气性能6) 包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水 润湿棉塞，外边再用一道麻绳扎好用记号笔注明培养基名称，组别，配制日期三角 瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结扎好，使用时容易解开，同样注明7) 灭菌 将配置好且包扎完毕的固体、液体培养基及本实验涉及的试管、三角瓶等及 400ml纯水于高压灭菌器中以0.14Mpa , 121C条件下高压蒸汽灭菌20分钟8) 斜面搁置将培养基冷却至50C左右时放置斜面,斜面在试管的1/2处为宜，待斜面凝固后， 放置于冰箱中待用1.2.2 菌种的筛选与保藏(1)倒平板将实验配制好的培养基加热溶化，待冷却至55—60C时，倒平板9皿⑹2) 稀释用接种环取菌种，放入盛90ml无菌水的三角瓶中，振摇。
用一支1ml无菌吸管吸 取1ml菌液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸 取1ml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1、10-2、10- 3、10-4、10-5、10-6 不同稀释度的菌液3) 划线将平板底面分别用记号笔写上10-4、10-5、10-6三种稀释度(共三组)然后用接种 环分别沾取浓度为10-4、10-5、10-6稀释液并对号在相应平板上划线，室温下静止 5— 10min,使菌液吸附进培养基4) 培养将培养基平板倒置于37弋的培养箱中，培养2—3天，观察淀粉圈对有淀粉圈的 菌落，测量淀粉圈的直径D，菌落直径r，计算D/r的比值，可进行拍照，选择淀粉圈 较大的菌落作为后续实验的菌种【7】5) 接种 接种到斜面培养基中，标注上日期等信息放入恒温培养箱中培养作为一级种子6) 保藏斜面置于37弋的培养箱中，培养2—3天，观察菌种长势好坏，若菌种长势好则将 其放入冰箱中保藏，若长势不好则需多次斜面转接。