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2分子生物学研究法上

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2分子生物学研究法上_第1页
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第五章 分子生物学研究法(上),,一、重组DNA技术发展史 二、DNA基本操作技术 三、RNA基本操作技术 四、SNP的理论与应用 五、基因克隆技术 六、蛋白质组与蛋白质组学技术,1、用内参基因的CT值确定目标基因的CT值:ΔCT (test)= CT (target,test) – CT (ref,test) ΔCT(calibrator)= CT (target, calibrator) – CT(ref, calibrator) 2、用校准样本的ΔCT值确定试验样本的ΔCT值:ΔΔCT= ΔCT(test) - ΔCT(calibrator)3、计算表达水平比率:(1+E) –ΔΔCT=表达量的比值,三、定量PCR: 相对定量分析法:-ΔΔCt法,1、用内参基因的表达量确定目标基因的表达量:2、试验样本的表达量除以校准样本的表达量,-△△CT方法的推导 PCR 指数扩增的公式是:这里,Xn 是第 n 个循环后目标分子数,X0 是初始目标分子数,Ex 是目标分子扩增效率,n 是循环数,C T 代表目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数因此:X T 是目标分子达到设定的阈值时的分子数。

C TX 是目标分子扩增达到阈值时的循环数Kx 是一个常数对于内参反应而言,也有同样的公式:用XT 除以RT 得到:假设目标序列与内参序列扩增效率相同:或:,XN 代表经过均一化处理过的初始目标分子量;△CT表示目标基因和内标基因CT值的差异(CTX-CTR )整理上式得:最后用任一样本q 的XN 除以参照因子(calibrator, cb)的XN得到:,分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质 狭义的分子标记专指DNA标记:能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段,它直接反映基因组DNA间的差异四、SNP (single nucleotide polymorphism ),常用的标记技术: 限制性片段长度多态性(RFLP) 随机扩增多态性DNA(Random amplification polymorphism DNA, 简称RAPD) 微卫星标记 单核苷酸多态性(SNP),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,A,B,A,B,限制性内切酶位点,与放射性探针 结合部位,①限制性内切酶酶切后; ②电泳分离DNA片段; ③转移至硝酸纤维素薄膜; ④与放射性探针杂交, ⑤分析阳性条带,1.限制性片段长度多态性标记(RFLP),,(1) SNP定义 SNP主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。

不同个体间,基因组DNA某部位的单核苷酸的变异2.SNP技术及应用,(2)SNP概述,1996年,Lander报道了用单核苷酸多态性标记制备第三代遗传连锁图的遗传标记 SNP在人类基因组中广泛存在,平均每300~1000个碱基对中就有1个,估计SNP总数至少可达300万个位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP位点被称作单倍型 三种SNP: 基因编码区SNP (cSNP); 基因调控区SNP (pSNP)与基因间随机非编码区SNP (rSNP) 同义cSNP 非同义cSNP cSNP与pSNP 在遗传性疾病研究中具有更重要的意义,因此cSNP的研究更受关注3)SNP的检测技术,通过DNA测序获得新的SNP 基因分型:利用数据库中已有的SNP进行特定人群的序列和发生频率的研究 1)基因芯片技术 该技术系指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交,通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息环一般为 15-30 个核苷酸,并与目标序列互补;茎一般 5-8个核苷酸长 环与目标序列互补,靶序列中存在错配碱基,分子信标与靶序列结合不稳定,不产生荧光。

3)分子信标技术,2)Taqman技术,4)焦磷酸测序法,(4)SNP的应用,A.人类基因单倍型图的绘制 B. SNP与疾病易感基因的相关性分析 C.指导用药与药物设计 通过检测SNP的遗传多态性标记揭示人群中不同个体对不同药物的敏感性差异的原因,,1、应用核酸探针分离克隆目的基因把基因文库转移到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上,就可以与特异性的核酸探针进行菌落或噬菌斑杂交,以便筛选出具有目的基因的阳性克隆,这个过程叫作克隆基因的分离或筛选五、基因克隆技术,,,裂解变性,,,,,,,,,,,,,,,,,,,显影,2. RACE技术,RACE技术(rapid amplification of cDNA ends)是一项在已知cDNA序列的基础上克隆5′端或3′端缺失序列的技术获得高质量总RNA,去磷酸化,去掉mRNA5′帽子结构加特异性RNA寡聚接头,合成第一条cDNA链,5′RACE,3′RACE,将纯化后的PCR产物克隆到载体DNA中,进行序列分析,,,,,,,,RACE主要操作方法,3、应用cDNA差示分析法克隆基因,根据表达特性的差异可将高等真核生物的基因分为两大类:一类叫做看家基因(house-keeping gene),以其组成型表达模式维持细胞的基本代谢活动;另一类叫做发育调控基因(developmental regulated gene),以其时空特异性表达模式完成个体的正常生长、发育与分化,,1)mRNA差别显示技术,不同基因在生物个体发育的不同阶段、在不同组织或细胞中或是在不同条件下发生的有差异的基因表达称为基因的差别表达( differential expression)。

1992年,美国波士顿Dena-Farber癌症研究所的两位科学家P. Liang和A. D. Pardee发明了一种叫做mRNA差别显示PCR(mRNA differential display)技术,简称DDRT-PCR,可以从一对不同基因型的细胞群体所产生的约15,000种mRNA中有效地鉴定并分离出差别表达的基因DDRT-PCR根据3′端PolyA序列起点前2个碱基除AA外只有12种可能性的特征,设计合成了12种下游引物,称3′-锚定引物,其通式为5′-T11MN;同时为扩增出polyA上游500bp以内所有可能性的mRNA序列,在5′端又设计了20种10 bp长的随机引物这样构成的引物对进行PCR扩增能产生出20000条左右的DNA条带,其中每一条都代表一种特定mRNA,这一数字大体涵盖了在一定发育阶段某种细胞类型中所表达的全部mRNADDRT-PCR的主要操作步骤如下:(1)从不同发育阶段或不同基因型的细胞群体中分离mRNA,并以3′锚定引物作为反转录的引物,合成第一链cDNA; (2)用5′随机引物与某个3′端锚定引物对扩增第二链(掺入32P-dNTP);,(3)用DNA变性测序胶分离扩增产物,X光片曝光后检测差别条带; (4)回收特异性差别条带; (5)用同一引物对扩增已回收的DNA条带; (6)用Northern,Southern及测序法分析所得的条带; (7)以该DNA片段做探针,筛选全长cDNA或核基因组文库。

2)应用cDNA差示分析法(RDA)克隆基因,RDA法发挥PCR以指数形式扩增双链DNA模板的特性,通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法,特异扩增目的基因片段 试验对象(Tester)和供试探针(Driver)先经4碱基切割酶处理,形成平均长度256 bp的代表群,然后通过PCR和杂交等步骤获得差异表达的基因试验对象 (Tester),供试探针 (Driver),4碱基切割酶处理,平均长度256bp的代表群,cDNA,cDNA,加12/24碱基接头,补平末端,以24碱基的互补序列为引物进行PCR,T改换新接头,D不加接头,杂交:T:D=1:100,设计新接头引物PCR,指数扩增产物差异产物,4、Gateway大规模克隆技术,Invitrogen公司开发的一种高效快速的基因大规模克隆技术Gateway克隆技术:利用λ噬菌体特异位点重组系统,并进行一系列修饰、改造,提高了其效率与特异性 Gateway克隆技术主要包括TOPO反应、 BP-LR反应Gateway技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆的步骤,而同时典型的克隆效率高达95%或更高。

采用Gateway技术,能够很容易将目的基因转化到其它的表达系统中,包括哺乳动物、昆虫、酵母和大肠杆菌来进行进一步的研究Gateway克隆技术的优点,1) TOPO反应,TOPO反应将目的基因PCR产物连入Entry载体,Entry载体,TOPO酶切,PCR产物,退火连接,切去3′GTGG后使PCR产物以正确的方向连入Entry载体,,,2) BP-LR反应,BP-LR反应被用于将目的片段从Entry载体中重组入表达载体,attR1和attR2位点目的载体接头,目的基因接头attL1和attL2位点,形成新的位点attB1 和attB2,目的基因被转移到表达载体中,,,,重组蛋白,,导入宿主,,图位克隆(map-based cloning)又称定位克隆(positional cloning),1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出,用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的,无需预先知道基因的DNA序列,也无需预先知道其表达产物的有关信息它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础5、基因的图位克隆法,基因的图位克隆法是利用表型分离未知性状目的基因的一种好方法。

首先,将目的基因定位到某个染色体的特定位点,并在其两侧确定紧密连锁的分子标记通过对许多不同的生态型及分子标记的分析,找出与目的基因距离最近的标记,将位于这两个标记之间的基因片段克隆并分离出来在作图中,连锁距离是根据重组率来计算的,1cm(厘摩)相当于1%的重组率Col0,,诱变,繁种 淘汰致死突变和不能繁殖突变,,筛选突变体,处理,Landsberg野生型,×,,确定突变体是否是单基因突变及显隐性,突变体筛选,,基因图位克隆,,,,,a,a,A,A,×,Col-0突变体,,Landsberg野生型,,F1,,,,,,,,,,,a,A,,×,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,1 2 3 4 5,1 2 3 4 5,,,,,,,,,a,A,,,,,,,,,,,,,,,a,A,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,A,,A,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,a,,a,F2,粗定位,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,a,,a,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,a,,a,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,a,,a,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,a,,a,,,,,maker,,,,,,Col-0,,Ler,,,,,,,,,,,,,,,,,,,单交换,双交换,不交换,不交换,重组率=,,单交换+2×双交换,2×样品总数,×100%,Col-0 Ler,Col-0 Ler,,,,在15个maker中,重组率最小者距目标基因最近,细定位,,a,,粗定位maker,,,,细定位maker,细定位maker,在3个maker中,重组率最小者目标基因距该maker最近,,循环若干次,六、蛋白质组与蛋白质组学技术,蛋白质组:一个物种、个体、器官、组织或细胞在特定条件、特定时间所表达的全部蛋白质。

蛋白质组学:指研究蛋白质组的技术及这些研究所得到的结果,其内容包括蛋白质鉴定、蛋白质的翻译后修饰及蛋白质功能确定等1、双向电泳技术,双向电泳(two dimension electrophoresis,2-D)是分离混合蛋白质最常用的方法 双向电泳由两部分构成:等电聚焦和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 该方法是依赖于蛋白质的等电点的不同和相对分子质量的不同而构建的。

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