植物硝酸还原酶（NR）活力测定（活体法）一、原理硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐,产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对-氨基苯磺酰胺）及a-萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物其反应如下：生成的红色偶氮化合物在540nm波长下有最大吸收峰，可用分光光度法测定硝酸还原酶 活性可由产生的亚硝态氮的量表示一般以Nyggihi为单位NR的测定可分为活体法和 离体法活体法步骤简单，适合快速、多组测定离体法复杂，但重复性较好二、 仪器与用具分光光度计；真空抽气泵（或20m 1注射器筒）；天平；单面刀片；保温箱（或恒温水 浴）；刻度试管（15ml）;移液管（5m1x2, 2m1x8， Im1x2）三、 试剂1. 亚硝酸钠标准液 称取分析纯NaNO2 O.lOOOg水溶后定容至100ml,吸取5ml用水稀释定 容至1000m 1，即为每ml含NaNO25yg （亚硝态氮近似lyg/m 1）的标准液2. 0.1mol/L pH7.5 的磷酸缓冲液：K2HPO419.24g, KH2PO4 2.2g，加水溶解后定容至 1000ml3. 1%（W/V）对-氨基苯磺酸溶液:称取10.0g加入250ml浓HCl中，用蒸馏水定容至1000ml。
4. 0.2%（W/V） a-萘胺溶液：称取2.0ga-萘胺溶于250ml冰醋酸中，用蒸馏水定容至1000ml5. 30%三氯乙酸溶液：75.0g三氯乙酸水溶后定容250ml6. KNO3 （0.1mol/L）、异丙醇（1% V/V）、磷酸缓冲液（0.1mol/L）混合液：称 10.10g KNO3溶于1000ml 0.1mol/L的磷酸缓冲液中，再加10ml异丙醇混匀四、方法1. 标准曲线制作取7支洁净烘干的15ml刻度试管按表13-1顺序加试剂，即配成020聘的系列标准亚 硝态氮溶液摇匀后在30°C保温箱或恒温水浴中保温30min,然后在540nm波长下比色 以亚硝态氮（yg）为横坐标，光密度值为纵坐标绘标准曲线或建立回归方程表 13-1 各试剂加入顺序12561022.0範1.4U4J144dj0 2佃赛届I1J4442. 酶反应和酶活性测定（1） 取样：将材料（小麦、玉米等作物叶片）洗净，用蒸馏水冲洗，滤纸吸干在叶 片中部打取直径1cm的圆片（或剪成0.5〜1.0cm2的小块），混匀后每个样品称0.3g 3份， 放入试管并编号2） 反应：向各试管加入KNO3・异丙醇•磷酸缓冲液混合液9ml,其中一管立即加1.0 ml三氯乙酸混匀作对照。
然后将所有试管置真空干燥器中接真空泵抽气，反复几次直至叶 片沉在管底将各试管置30°C下于黑暗处保温30min，分别向处理管加1.0ml三氯乙酸，摇 匀终止酶活性3） 比色：将各试管静置2min，吸取上清液2ml加入另一组试管，以对照管做参比， 按标准曲线做法进行显色测定，并计算酶活性（Nygg1・h-1）样品中葩活性（pg - g「-・tr尊=—旷覽t— 式中C:反应液催化产生的亚硝态氮总量（yg）;V1:反应液总体积（ml）;V2:反应时加入的提取液体积（ml）;W:样品重量（g）;t:反应时间（h）。