链霉素耐药细菌的分离及鉴定摘要：本实验对江和河道水源中链霉素耐药细菌的分离及鉴定， 判断水体的链霉素污染情况实验先通过含链霉素及不含链霉素的 LB 固体培养基培养、计数、筛选有耐药性的细菌，再采用连续梯度 稀释法纯化、16S rDNA扩增法进行分子鉴定，完成对耐药菌初步鉴 定实验结论对预防和减缓水源耐药性细菌问题，为以后耐药性机制 的研究及寻找新型抗生素积累菌种资源有重要意义关键词：链霉素 耐药细菌 分离鉴定链霉素(streptomycin )是一种氨基葡萄糖型抗生素，属于氨基 糖甙碱性化合物，分子式C21H39N7O12链霉素能与30s亚基结合 并影响蛋白质合成的多个环节从而起到杀菌的作用其结构为一分子 链霉素胍和一分子链霉双糖胺结合而成的碱性苷链霉素为白色无定 形粉末，在酸性条件下可以水解成链霉胍和链霉双糖胺，进一步水解 可得到N-甲基-L-葡萄糖胺在弱碱性情况下也可以水解得到链霉胍 和链霉双糖胺，但进一步水解即将链霉糖部分重排为麦芽酚，麦芽酚 可以跟Fe3+反应生成紫红色配合物，这是链霉素的特有反应，可用 于其鉴别，亦可用作含量测定链霉素分子中还有醛基，可以被氧化 剂氧化而降低抗菌活性。
细菌耐药性也称细菌抗药性，是指细菌能抵御抗生素影响的能 力细菌耐药性按传统的分类方法分为固有耐药性和获得耐药性固 有耐药性也叫做天然耐药性，是细菌对抗菌药的天然不敏感，由于具 有这种特点的细菌不具有药物的作用靶点而产生耐药性获得耐药性 是细菌在长期接触抗菌药物情况下发生变异，从而获得耐药性这种 耐药性包括交叉耐药性、单向耐药性和多重耐药性细菌获得耐药性 发生的机制可分为遗传学机制和生化机制目前由于大量地使用链霉素，导致链霉素在一些食品和生物体中 有残留含链霉素废水排入天然水体中，是链霉素的存在于自然环境 中的关键原因链霉素的残留又是导致耐药细菌产生的重要原因，所 以必须对环境、农产品和食品中链霉素残留量进行检测，避免链霉素 通过食物链在某一生物体内积累1 材料和方法1.1 材料1.1. 1 耗材 离心管（1.5ml）、PCR扩增管（0.2ml）、枪头（10卩1、200^1、1ml）、1.5ml离心管盒、45mm过滤器、0.25ym滤膜等1.1.2 仪器和试剂 移夜枪、 pH 计、培养箱、 H1650 电泳仪及电 泳槽（北京六一仪器厂）、高速离心离心机、PCR仪（PTC100, MJ 公司）蛋白胨、酵母浸膏、链霉素（Genview）、16S rDNA引物（F27、R1492,上海英骏生物技术有限公司)、Taq酶(上海申能博彩)等2 方法2.1预处理 培养皿、试管、移液枪枪头、过滤器等的灭菌；LB 培养的配制；链霉素(1.6 mg/ml)的配制；抗生素平板的制备，将灭 好菌的装有50ml LB固体培养基的三角瓶放入60°C水浴锅中，在水 浴锅中保温半小时，使培养基的温度不超过50C，然后取出三角瓶， 加入链霉素(0.8 mg/ml) 225^1，摇匀，于无菌台上倒平板，每个平 板所加的培养基约为15ml，平板倒好冷却后，立即放入避光环境下。
37 C培养箱中放置过夜2.2 耐药性菌株的筛选从R1河流及R2河流中取得水样，取200^1水样涂布在含抗生素 的平板上，另将原水样稀释成10-1和10-2，分别取100卩1涂布在不 含抗生素的平板上作对照，平衡涂布3个平板，置于37C培养箱中 培养24h第二天观察并计录单菌落数，同时计算细菌的耐药率并 从含抗生素平板上挑取菌落比较特殊的单菌落进行下一步的纯化鉴 定2.3 耐药性细菌菌株的纯化及保藏对所挑取的耐药性细菌菌株采用梯度稀释法进行纯化用无菌的 接种环将挑取的单菌落接到含有0.5ml LB液体培养基的1.5ml离心管 中，振荡混匀后，作为原液，然后进行 10 倍的稀释至 10-4 和 10-5， 取这两个稀释度的悬浮液100卩1涂布在固体培养基上，置于37°C培养 箱中培养24h重复三次培养得到单菌落，对单菌落进行观察并记 录菌落形态和大小，并接种到3ml LB液体培养基的试管中，37C摇 床中，200rpm,振荡培养24h取无菌的1.5ml离心管于离心管盒中， 在管盖上标上抗生素、菌株编号和日期用200^1移液枪吸取200^1 50%甘油到1.5ml离心管中，再加入800^1上述菌液到离心管中，颠 倒混匀，于-20C冰箱中保存。
2.4 耐药性细菌菌株的 MIC 测定配制链霉素浓度梯度的LB液体培养基：0yg/m1、10yg/m1、 20pg/m1、40pg/m1、80pg/m1、160pg/m1，分别接种 10p!上述纯化得 到的细菌的菌液，于37C摇床中，200rpm，振荡培养24h，第二天观 察细菌生长情况，以在试管内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为 MIC2.5 革兰氏染色革兰氏染色及镜检涂片干燥、加热固定冷却结晶紫初染、碘液媒 染酒精脱色番红复染、干燥镜检2.6 16S rDNA 序列扩增及分析2.6.1将上述得到的纯种接种至LB液体培养基中培养过夜，取 lOOp!菌液至无菌1.5ml离心管中，以10000rpm离心2min,用枪吸 去上清夜；加入lOOpl的无菌水，振荡重悬菌体，于100°C水浴锅中 煮10min以破壁，冷却至室温后以12000rpm离心2min，吸取50pl 上清夜至另一个无菌的离心管中作为16S rDNA扩增的DNA模板 采用细菌 16S rDNA 通用引物 F27(5´- AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG -3´)及 R1492(5´- GGT TAC CTT GTT ACG ACT T -3´)，按以下反应体系进行 PCR：PCR 程序：94C， 3 min94C， 45 sec58C， 45 sec72C， 90 sec， 30 cycles72C， 10 min10C， 10minlOxPCR buffer5pldNTPs4plF27 引物(10pmol/pl) 2plR1492 引物（lOpmol/yl） 2卩1DNA模板2ylrTaq（ 5U/yl） O.3ylddH2O34.7ylTotal 5Oyl2.6.2凝胶电泳：吸取PCR扩增产物5yl与lp! 6xloading buffer 混合，上样至凝胶的小孔上（负极），接上电源，电泳60min,电压 为120伏。
电泳完后，将凝胶取出放入溴化乙锭液中，浸泡15min， 取出凝胶放入凝胶成像仪中进行凝胶成像2.7 16S rDNA的测序及序列分析将扩增产物直接送到上海英骏测序公司进行测序，测序结果使用 phrap（V0.990329）拼接，去掉两端低质量序列（质量低于40），将 得到的16S rDNA序列用blastn（2.2.14）比对NCBI的核酸数据库 （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）3 结果3.1 耐链霉素细菌分离结果从河流 R1 及 R2 采集水样进行耐链霉素细菌的分离，参考美国 标准委员会（NCCLS） 2004年的标准，介定耐链霉素细菌的最低抑 制浓度为10?g/ml,结果表明两河流水样都能筛选到耐链霉素的菌株, 其中R1水样的可培养细菌的耐药率为0.167%，而R2的可培养细菌 的耐药率为0.119%此外R1河道的3次采样中，各次空白对照的可 培养的细菌数在105左右，3次平均值为1.32x105，R2的可培养的 细菌数在104左右，3次平均值为2.1x104,只有R1细菌数平均值的 7/44从含链霉素抗生素的 LB 固体培养基平板上随机挑取了一株细 菌，经过梯度稀释法纯化，得到的纯种编号为Sm5,其中Sm是链霉 素的英文缩写。
细菌大小形状颜色透明度湿度表面 Sm51.1mm 圆形白色不透明湿润凸起3.3 Sm5 的 MIC 测定结果对两株耐链霉素细菌进行链霉素最低抑制浓度（MIC）测定，结 果Sm5能够在链霉素浓度0〜80yg/ml的LB液体培养基生长，但在 链霉素浓度160yg/ml的LB液体培养基不生长，因此Sm5的最低抑 制浓度MIC为160yg/mlNCCLS对链霉素的MIC标准是10yg/ml， 该细菌的 MIC 是 NCCLS 标准的 16 倍，该细菌为强耐药菌株表3进行链霉素最低抑制浓度（MIC）测定结果链霉素浓度（yg/ml）010204080160生长状况+++++++-注：++生 长良好，+ 生长，- 不生长3.4 Sm5 的革兰氏染色结果Sm5 经革兰氏染色后，在40 倍数码显微镜下观察细胞呈红色， 是革兰氏阴性细菌，它的细胞呈长杆形，长约1.0〜2.0ym,宽约0.3〜 0.5ym3.5 Sm5的16S rDNA的扩增结果采用细菌16S rDNA扩增的通用引物F27和R1492进行扩增,Sm5 的条带见图2的泳道4，能扩增出1.5kb左右的目的片段3.6 Sm5的16S rDNA的测序及序列分析本次实验所得到的Sm5的16S rDNA的扩增目的产物直接送到上 海英骏测序公司广州分公司进行纯化并测序，得到的序列峰图杂峰很 少，去掉低质量及拼接，所得到的 Sm5 16S rDNA 的序列长度为 1415bp 。
把 此 序 列 在 NCBI 的 核 酸 数 据 库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）进行 blast 比对分析，blast 结 果如下：4 结论本实验对中山市区的 R1 河道及 R2 进行耐链霉素细菌调查，按 照美国国家临床实验室标准委员会（NCCLS）的标准（10yg/ml），两 处的耐药率分别为0.167%和 0.119%随机筛选得到一株细菌，记为 Sm5，进行MIC检测发现，Sm5的MIC为160“g/m,是NCCLS标 准的 16 倍，该细菌耐链霉素强对 Sm5 进行了初步鉴定， 16S rDNA 的测序结果表明它属于 Pseudomonas plecoglossicida (革兰氏阴性细菌)由于 Pseudomonas plecoglossicida 是一种鱼类致病菌，可在以后的研究中对它的耐药谱 进行检测以及对它的耐药机制进行研究如耐药基因定位等因此本实 验为今后耐药性机制的研究及寻找新型抗生素积累宝贵的菌种资源参考文献[1] 杨智洪, 杜根成等. 链霉素残留检测方法的研究进展. 上海 畜牧兽医通讯[J]. 2005, 5: 2〜4.[2] 董晓庆, 程培英, 陈绍辉, 等. 鸡组织中链霉素残留量检测 方法的研究.吉林农业大学学报[J].2005, 27(3): 339〜343.[3] 蔡金华, 刘雅妮, 顾欣. 链霉素在牛奶中残留的微生物学检 测方法.中国兽药杂志[J]. 2004, 38(11)： 7〜9.[4] 神保胜彦等.食品卫生学杂志[J]. 1991, 32(2): 86〜92.[5] 王永明, 黄耀凌, 王鹤佳, 等. 链霉素酶联免疫检测试剂盒的稳定性研究.中国兽药杂志[J]. 2007, 41(7): 23〜24.[6] 赵锐.细菌耐药性发生、发展与耐药机制.中国水电医学[J]. 2007, (4): 251 〜253.[7] 张兆山 主编. 病原细菌生物学研究与应用 [M]. 北京: 化学 工业出版社, 2007.6.[8] 王睿，柴栋. 细菌耐药机制与临床治疗对策 . 国外医药抗生 素分册[J]. 2003, 24(3): 97〜102.[9] 王兰. 抗生素污染现状及对环境微生态的影响 . 药物牛物技 术. 2006, 13(2): 144〜148.[10]。