青霉素的生产工艺摘 要 ： 青霉素是人类最早发现的抗生素，也是一种重要的抗生素，在目前制药工业中有着极其重要的地位其杀伤革兰氏阳性菌的功效几乎人人都领教过通过多年的 研究与完善，青霉素相关药品已能用于治疗肺炎、脑膜炎、心内膜炎等病，它不仅增强了人 类治疗传染性疾病的能力，而且对研究药物学和优化生产工艺对人类的健康有重要意义关键词：青霉素 提取 生产1 青霉素概述青霉素(Benzylpenicillin / Penicillin) 又被称为青霉素 G、peillin G、 盘尼西林、配尼西林、青霉素钠、苄青霉素钠、青霉素钾、苄青霉素钾青霉素 是抗菌素的一种，是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌 的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是第一种能够治疗人 类疾病的抗生素青霉素类抗生素是0-内酰胺类中一大类抗生素的总称青霉素 是一个典型的利用生物工程技术生产的产品，生产工艺涉及配料、发酵、过滤、 提取、结晶、干燥等重要的单元操作1.1 青霉素简介1.1.1 名称与化学结构式中文名：青霉素英文名：Benzylpenicillin / Penicillin化学名：1-乙氧甲酰乙氧6-〔D(-)-2-氨基-2-乙酰氨基〕青霉烷酸盐酸盐分子式： C16H18N3O4S?HCl分子量： 384.51.1.2 性状与理化性质青霉素为白色结晶性粉末、无臭，有吸湿性，易溶于水、水溶液易失效，不 耐热。
对革兰氏阳性菌作用强，对阴性菌作用弱，对真菌无作用2 青霉素生产工艺2.1 青霉素生产工艺流程概述青霉素生产工艺主要分为：发酵、过滤、萃取、脱色、结晶其生产工艺流 程，如图 2.1：冷冻干燥抱子 琼脂斜面 米抱子 种子罐 发酵罐过滤 醋酸丁酯提取 脱水脱色 结晶 洗涤晶体 工业盐 菌丝 综合利用图 2.1 青霉素的生产工艺流程简图2.2 发酵工艺流程2.2.1 生产孢子的制备将沙土保藏的孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨组成的培养基进行斜面培养，经 传代活化最适生长温度在25~26°C培养6~8天，得单菌落，再传斜面，培养7 天，得斜面抱子移植到优质小米或大米固体培养基上，生长7天，25C，制得 小米孢子2.2.2 种子罐和发酵罐培养工艺种子培养要求产生大量健壮的菌丝体，因此，培养基应加入比较丰富的易利 用的碳源和有机碳源青霉素采用三级发酵：一级种子发酵：发芽罐，小罐，接入小米孢子后孢子萌发，形成菌丝培养 基成分:葡萄糖，蔗糖，乳糖，玉米浆，碳酸钙，玉米油，消沫剂等通入无菌空 气，空气流量是1:3 （体积比）；充分搅拌300-500r/min； 40~50小时；pH自然， 温度 27二级发酵罐发酵：繁殖罐大量繁殖。
玉米浆、葡萄糖等 1:1-1.5； 250-280r/min； pH 自然，0-14h三级发酵罐发酵：生产罐花生饼粉（高温），麸质粉，玉米浆、葡萄糖，尿 素，硫酸铵，硫酸钠、硫代硫酸钠，磷酸二氢钠，苯乙酸铵及消泡剂， CaCO3 等 接种量为 12~15%青霉素的发酵对溶氧要求极高，通气量偏大，通气比控制 0.7~1.8； 150-200r/min；要求高效率搅拌100m3的发酵罐搅拌功率在200~300Kw, 罐压控制在0.04~0.05Mpa，于25~26C下培养，发酵周期在200h左右前60h， pH5.7~6.3，温度为 26° C后 6.3~6.6；温度为 24C2.3发酵过程中的工艺控制2.3.1 影响因素2.3.1.1 温度青霉素发酵的最适温度随所用菌株的不同可能稍有差别 , 但一般认为应在25 °C左右温度过高将明显降低发酵产率，同时增加葡萄糖的维持消耗，降 低葡萄糖至青霉素的转化率对菌丝生长和青霉素合成来说 , 最适温度不是一样 的， 一般前者略高于后者， 故有的发酵过程在菌丝生长阶段采用较高的温度，以 缩短生长时间， 到达生产阶段后便适当降低温度 ， 以利于青霉素的合成。
2.3.1.2 pH青霉素发酵的最适 pH 值一般认为在 6. 5 左右 ， 有时也可以略高或略低 一些 ， 但应尽量避免 pH 值超过 7.0， 因为青霉素在碱性条件下不稳定 ， 容易 加速其水解在缓冲能力较弱的培养基中， pH 值的变化是葡萄糖流加速度高低的 反映过高的流加速率造成酸性中间产物的积累使 pH 值降低； 过低的加糖速率 不足以中和蛋白质代谢产生的氨或其他生理碱性物质代谢产生的碱性化合物而引 起 pH 值上升2.3.1.3 溶氧对于好氧的青霉素发酵来说 ， 溶氧浓度是影响发酵过程的一个重要因素当 溶氧浓度降到 30% 饱和度以下时， 青霉素产率急剧下降， 低于 10% 饱和度时， 则造成不可逆的损害溶氧浓度过高 ， 说明菌丝生长不良或加糖率过低， 造成呼 吸强度下降， 同样影响生产能力的发挥溶氧浓度是氧传递和氧消耗的一个动态 平衡点， 而氧消耗与碳能源消耗成正比， 故溶氧浓度也可作为葡萄糖流加控制的 一个参考指标2.3.1.4 基质浓度 在分批发酵中，常常因为前期基质量浓度过高，对生物合成酶系产生阻遏（或 抑制）或对菌丝生长产生抑制（如葡萄糖和钱的阻遏或抑制 ， 苯乙酸的生长抑制）， 而后期基质浓度低限制了菌丝生长和产物合成 ， 为了避免这一现象 ， 在青霉素 发酵中通常采用补料分批操作法 ， 即对容易产生阻遏、抑制和限制作用的基质进 行缓慢流加以维持一定的最适浓度。
这里必须特别注意的是葡萄糖的流加 ， 因为 即使是超出最适浓度范围较小的波动 ， 都将引起严重的阻遏或限制 ， 使生物合 成速度减慢或停止目前 , 糖浓度的检测尚难进 行 , 故葡萄糖的流加不是 依据糖浓度控制 , 而是间接根据 pH 值、溶氧或 C02 释放率予以调节2.3.1.5 菌丝浓度发酵过程中必须控制菌丝浓度不超过临界菌体浓度 , 从而使氧传递速率与氧 消耗速率在某一溶氧水平上达到平衡青霉素发酵的临界菌体浓度随菌株的呼吸 强度 （取决于维持因数的大小, 维持因数越大,呼吸强度越高） 、发酵通气与搅拌 能力及发酵的流变学性质而异呼吸强度低的菌株降低发酵中氧的消耗速率，而 通气与搅拌能力强的发酵罐及黏低的发酵液使发酵中的传氧速率上升, 从而提高 临界菌体浓度2.3.1.6 菌丝生长速度用恒化器进行的发酵试验证明，在葡萄糖限制生长的条件下，青霉素比生产 速率与产生菌菌丝的比生长速率之间呈一定关系当比生长速率低于 0.015h-1 时，比生产速率与比生长速率成正比, 当比生长速率高于 O. 015h-1 时, 比生产 速率与比生长速率无关 D 因此, 要在发酵过程中达到并维持最大比生产速率 , 必须使比生长速率不低 0.015h-1 。
这一比生长速率称为 临界比生长速率对于 分批补料发酵的生产阶段来说, 维持 0.015h 斗的临界比生长速率意味着每 46h 就要使菌丝浓度或发酵液体积加倍, 这在实际工业生产中是很难实现的事实上 , 青霉素工业发酵生产阶段控制的比生长速率要比这一理论临界值低得多, 却仍然 能达到很高的比生产速率这是由于工业上采用的补料分批发酵过程不断有部分 菌丝自溶, 抵消了一部分生长, 故虽然表观比生长速率低, 但真比生长速率却要 高一些2.3.1.7 菌丝形态长期的菌株改良中 , 青霉素产生菌在沉没培养中分化为主要呈丝状生长和 结球生长两种形态前者由于所有菌丝体都能充分和发酵液中的基质及氧接触 , 故一般比生产速率较高； 后者则由于发酵液黏度显著降低, 使气-液两相间氧的 传递速率大大提高, 从而允许更多的菌丝生长 （即临界菌体浓度较高 ）, 发酵罐 体积产率甚至高于前者在丝状菌发酵中, 控制菌丝形态使其保持适当的分支和 长度, 并避免结球 , 是获得高产的关键要素之一而在球状菌发酵中, 使菌丝球 保持适当大小和松紧 , 并尽量减少游离菌丝的含量 , 也是充分发挥其生产能力 的关键素之一这种形态的控制与糖和氮源的流加状况及速率、搅拌的剪切强度 及比生长速率密切相关。
2.3.1.8 泡沫 发酵过程中泡沫较多，需补入消泡剂天然油脂：玉米油；化学消泡剂：泡 敌少量多次不适在前期多加入，影响呼吸代谢2.3.2 工艺控制要点2.3.2.1 种子质量控制 丝状菌的生产种子是由保藏在低温的冷冻安瓿管经甘油、葡萄糖、蛋白胨斜 面移植到小米固体上，25 °C培养7天，真空干燥并以这种形式保存备用生产 时它按一定的接种量移种到含有葡萄糖、玉米浆、尿素为主的种子罐内,26 C培 养 56h 左右， 菌丝浓度达 6%-8%， 菌丝形态正常， 按 10%-15%的接种量移人含 有花生饼粉、葡萄糖为主的二级种子罐内，27°C培养24h,菌丝体积10%-12%,形 态正常, 效价在 700D/ml 左右便可作为发酵种子球状菌的生产种子是由冷冻管子孢子经混有 O. 5% -1. 0 %玉米浆的三角 瓶培养原始亲米孢子, 然后再移人罗氏瓶培养生产大米抱子 （又称生产米）, 亲 米和生产米均为25 C静置培养，需经常观察生长发育情况在培养到3-4天, 大米表面长出明显小集落时要振摇均匀, 使菌丝在大米表面能均匀生长, 待 10 天左右形成绿色孢子即可收获亲米成熟接人生产米后也要经过激烈振荡才可放 置恒温培养, 生产米的孢子量要求每粒米300万只以上。
亲米、生产米子孢子都 需保存在5 C冰箱内工艺要求将新鲜的生产米 （指收获后的孢瓶在 10 天以内使用） 接人含有花 生饼粉、玉米胚芽粉、葡萄糖、饴糖为主的种子罐内，28°C培养50-60h当pH值 由6. 0-6. 5下降至5.5-5. 0,菌丝呈菊花团状，平均直径在100- 130^m,每 毫升的球数为 6 万 -8 万只, 沉降率在 85% 以上, 即可根据发酵罐球数控制在 8000-11000只/ml范围的要求，计算移种体积，然后接入发酵罐，多余的种子 液弃去球状菌以新鲜孢子为佳, 其生产水平优于真空干燥的孢子，能使青霉素 发酵单位的罐批差异减少2.3.2.2 培养基成分控制a. 碳源 生产菌能利用多种碳源，乳糖，蔗糖，葡萄糖，阿拉伯糖，甘露糖， 淀粉和天然油脂目前生产上普遍采用的是淀粉水解糖、糖化液 （DE 值 50% 以 上） 进行流加降低成本b. 氮源 氮源常选用玉米浆、精制棉籽饼粉、麸皮，并补加无机氮源（硫酸 氨、氨水或尿素）c. 前体 生物合成含有苄基基团的青霉素 G, 需在发酵液中加人前体前体 可用苯乙酸、苯乙酰胺, 一次加入量不大于 0.1%, 并采用多次加入, 以防止前体 对青霉素的毒害。
d. 无机盐加人的无机盐包括硫、磷、钙、镁、钾等, 且用量要适度另外, 由 于铁离子对青霉菌有毒害作用，必须严格控制铁离子的浓度，一般控制在30 ix g/ml 2.3.2.3 发酵培养控制a. 加糖控制 加糖量的控制是根据残糖量及发酵过程中的 pH 值确定 ， 最 好是根据排气中 CO2 量及 O2 量来控制， 一般在残糖降至 0.6% 左右， pH 值上 升时开始加糖b. 补氮及加前体 补氮是指加硫酸铵、氨水或尿素， 使发酵液氨氮控制在 O. 01%-0.05%， 补前体以使发酵液中残存苯乙酰胺浓度为 0.05%-0.08% c. pH 值控制 对 pH 值的要求视不同菌种而异， 一般为 pH 6.4-6.8， 可以 补加葡萄糖来控制目前一般采用加酸或加碱控制pH值d.温度控制前期2 5 2 6 °C,后期23°C,以减少后期发酵液中青霉素的降解破坏e.溶解氧的控制 一般要求发酵中溶解氧量不低于饱和溶解氧的 30% 通风比一般为1 : 0. 8L/（L ? min）, 搅拌转速在发酵各阶段应根据需要而调整。