单击此处编辑母版标题样式,,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,,,*,第三章 培养基及其配制,,培养基是植物组织培养的重要基质在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同，只有满足了它们各自的特殊要求，它们才能很好地生长因此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基，培养才有可能成功第一节 培养基成分及作用,主要成分包括：无机盐类（大量和微量元素）、维生素类、氨基酸类、有机附加物、植物生长调节物质、糖类，水和琼脂等1.,大量元素：,指浓度大于,0.5mmol,／,L,的元素等1)N,：,是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等,,的组成成分，在制备培养基时以,NO,3,—N,和,NH,4,—N,两种,,形式供应2)P,：是磷脂的主要成分常用的物质有,KH,2,P0,4,或,NaH,2,P0,4,,(3)K,：,对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系制备培养基时，常以,KCI,、,KN0,3,等盐类提供4)Mg,、,S,和,Ca,、,Mg,：,,,是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂；,S,是含,S,氨基酸和蛋白质的组成成分。
它们常以,MgSO,4,·7H,2,0,提供Ca,是构成细胞壁的一种成分，,Ca,对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用，常以,CaCl,2,·2H,2,O,提供2.,微量元素,：,指小于,0.5mmol,／,L,的元素,,主要有,Fe,，,B,，,Mn,，,Cu,，,Mo,，,Co,等铁,是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分同时，它又是叶绿素形成的必要条件培养基中的铁对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用在制做培养基时不用,Fe,2,SO,4,，和,FeCl,3,(,因其在,pH,值,5,．,2,以上，易形成,Fe(OH),3,的不溶性沉淀,),，而用,FeSO,4,·7H,2,0,和,Na,2,—EDTA,结合成合物使用B,，,Mn,，,Zn,，,Cu,，,Mo,，,Co,等，也是植物组织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长、发育异常现象3.,有机化合物,,⑴碳水化合物,：,最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源，可支持许多组织很好的生长蔗糖使用浓度在,2%—3%,，常用,3%,高压灭菌时，一部分糖会发生分解，制定配方时要给予考虑在大规模生产时，可用食用的绵白糖代替。
⑵维生素,：,这类化合物主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用主要有,VBl(,盐酸硫胺素,),、,VB6(,盐酸吡哆醇,),、,Vpp(,烟酸,),、,Vc,（抗坏血酸）、有时还使用生物素、叶酸、,VB12,等一般用量为,0.1—1.0mg,／,L,VB1,对愈伤组织的产生和生活力有重要作用，,VB6,能促进根的生长，,Vpp,与植物代谢和胚的发育有一定关系Vc,有防止组织变褐的作用生长培养基是植物再生的必要条件,蔗糖 （,0%,）,,蔗糖含量（,,1%,）,蔗糖含量,（,5%,）,外植体完全被绿色的芽所包裹，根生长在其下表面,在外植体上既没有芽发生，也没有根和愈伤组织产生,在外植体上表面边缘产生芽，也有一些根发生,芽从外植体的上表面发生而根从下表面发生,tissue culture in the African Violet,,(3),肌醇又叫环己六醇,：,在糖类的相互转化中起重要作用使用浓度一般为,l00mg,／,L,，适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用⑷氨基酸：,是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。
培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用4.,有机附加物,：,其对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明显其成分大多不清楚，所以一般应尽量避免使用常用的有机附加物有,:,,⑴,椰乳：,,⑵香蕉：,,⑶水解酪蛋白：,5.,植物生长调节物,,植物激素是植物新陈代谢中产生的天然化合物，它能以极微小的量影响到植物的细胞分化、分裂、发育，影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠以及萌发等许许多多的生理生化活动，在培养基的各成分中，植物生长调节物是培养基的关键物质，对植物组织培养起着决定性作用5.1,生长素类,(auxin),：,,,在组织培养中，生长素主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长在促进生长方面，根对生长素最敏感，在极低的浓度下，就可促进根生长，其次是茎和芽天然的生长素热稳定性差，高温高压或受光条件易被破坏在植物体内也易受到体内酶的分解一般生长素浓度的使用为,0.05,－,5mg,／,L,⑴IAA(,吲哚乙酸,),是天然存在的生长素，亦可人工合成，其活力较低，是生长素中活力最弱的激素，对器官形成的副作用小、，高温高压易被破坏，也易被细胞中的,1AA,分解酶降解，受光也易分解。
⑵,NAA(,萘乙酸,),在组织培养中的起动能力要比,IAA,高出,3-4,倍，且由于可大批量人工合成，耐高温高压，不易被分解破坏，所以应用较普遍NAA,和,IBA,广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长⑶,IBA(,吲哚丁酸,),是促进发根能力较强的生长调节物质⑷,2,，,4—D(2,，,4—,二氯苯氧乙酸,),起动能力比,IAA,高,10,倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育适宜的用量范围较狭窄，过量常有毒效应5.2,细胞分裂素类,,细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化和茎、苗的增殖，而在生根培养时使用较少或用量较低这类激素是腺嘌吟的衍生物，包括,6,－,BA(6,－苄基氨基嘌呤,),、,Kt (kinetin,激动素,),、,Zt (zeatin,玉米素,),等，细胞分裂素,0.05,－,10mg,／,L,其中,Zt,活性最强，但非常昂贵，常用的是,6—BA,在培养基中添加细胞分裂素有三个作用：,,①诱导芽的分化促进侧芽萌发生长②促进细胞分裂与扩大③抑制根的分化5.3,激素配比模式,,生长素与细胞分裂素：它们的比例决定着发育的方向，是愈伤组织、长根还是长芽。
如为了促进芽器官的分化，应除去或降低生长素的浓度，或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例高：有利于根的形成和愈伤组织的形成；,,适中：有利于根芽的分化；,,低：有利于芽的形成,生长素,/,细胞分裂素比例,No BAP,,,BAP reduced to 0.1 mg. l,-1,,No NAA,,Poor shoot development and no roots. Extensive callus generation,,Poor shoot development and no roots,,NAA reduced to 0.1 mg. l,-1,,,More balanced development of roots and shoots. However, undifferentiated callus is developing at the edges of the explant,Profuse development of roots and a reduced number of shoots. Undifferentiated callus is developing at the edges of the explant,,NAA increased to 5.0 mg. l,-1,,Profuse development of roots over the explant upper and lower surface, and few shoots. Some callus,,No MS salts,,No sign of regeneration from explant at all.,,MS salts reduced to 0.47 g. l,-1,,,Some root growth but reduced development of shoots,,MS salts increased to 9.52 g. l,-1,,,Shoots developed on upper surface of explant. No roots or callus,.,GA (,赤霉素,),：,,有,20,多种，生理活性及作用的种类、部位、效应等各有不同、培养基中添加的是,GA,3,，主要用于促进幼苗茎的伸长生长，促进不定胚发育成小植株；赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响，当生长素／赤霉素比值高时有利于木质部分化，比值低时有利于韧皮部分化；此外，赤霉素还用于打破休眠，促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。
一般在器官形成后，添加赤霉素可促进器官或胚状体的生长6.,抗生物质,,抗生物质有青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在,5—20mg/L,之间添加抗生物质可防止菌类污染，减少培养中材料的损失对于刚感染的组织材料，可向培养基中注入,5%—10%,的抗菌素活性炭的应用,：,,⑴茎尖初代培养，可以吸附外植体产生的致死性褐化物，一般为,0.1%—0.2%,，不能超过,0.2%,⑵活性炭在生根时有明显的促进作用，可能是通过减弱光,,照保护,IAA,⑶降低玻璃苗的产生频率，对防止产生玻璃苗有良好作用，一般浓度为,0.3%,7.,活性炭,,活性炭结构疏松，孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用通常使用浓度为,0.5—l0g,／,L,它可以吸附非极性物质和色素等大分子物质⑷,活性炭在胚胎培养中也有一定作用,，如在葡萄胚珠培养时向培养基加入,0.1%,的活性炭，可减少组织变褐和培养基变色，产生较少的愈伤组织但是，活性炭具有副作用，研究表示，每毫克的活性炭能吸附,l00ng,左右的生长调节物质，这说明只需要极少量的活性炭就可以完全吸附培养基中的调节物质大量的活性炭加入会削弱琼脂的凝固能力，因此要多加一些琼脂很细的活性炭也易沉淀，通常在琼脂凝固之前，要轻轻摇动培养瓶。
总之，那种随意抓一撮活性炭放人培养基，会带来不良的后果因此，在使用时要有其量的意识，使活性炭发挥其积极作用８、琼脂,,琼脂,(agar),是固体培养基的必要成分，琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至,40℃,即凝固为固体状凝胶通常所说的“煮化”培养基，就是使琼脂溶解于,90℃,以上的热水琼脂条的用量在,6—10g,／,L,之间，琼脂粉的用量在,3—4g,／,L,之间若浓度太高，培养基就会变得很硬，营养物质难以扩散到培养的组织中去若浓度过低，凝固性不好新买来的琼脂最好先试一下它的凝固力一般琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品第二节 培养基配制及注意事项,(,一,),母液配制的目的,,,,方便配置其他培养基；,,保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取,(,二,),母液配制方法,（一）单配法：将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓度的母液一般用,a:b,表示，即每,b,毫升溶液中含有,a,毫克溶质二）混配法：将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数称量，分别溶解后每一类混合在一起定容到一定体积配成混合母液，浓度可用,a mg/L,表示，即配制一升培养基吸取该母液,a ml.,,一、培养基母液的配制,（三）母液配制的药品与器材,1,、药品,：,配制,MS,培养基所需的药品、生长调节物质、蒸馏水、,0.1mol/L,的,NaOH,，,0.1mol/L,的,HCL,2,、器材：,各类天平、烧杯、容量瓶、量筒、,,母液瓶、标签、冰箱等。
四）母液配制（以,MS,培养基为例）,有机物母液,铁盐母液,无机大量 母液,无机微量母液,激素母液,配制,MS,培养基时母液的计算,1,、无机大量母液,(,扩大,10,倍配,1L ),,成 分,硝酸钾 硝酸铵,,硫酸镁 磷酸二氢钾,,氯化钙,称量工具,,托盘天平,,注意,：,无机大量母液中的各种物质在混合过程中有些离子易产生沉淀，应使每种物质先充分溶解，再进行混合，而且钙盐最后缓慢加入进去硼酸，硫酸铜，,,硫酸锰，硫酸锌，,,氯化钴，钼酸钠，,,碘化钾,,托盘天平和电子天平,2,、无机微量母液（扩大,100,倍配,1000ml,）,称量工具,成分,,3,、铁盐（扩大,100,倍,1000ml,）,铁盐,硫酸亚铁，,,Na,2,-EDTA,注意：,铁盐采用托盘天平称取铁盐选用硫酸亚铁而不用硫酸铁，是因为它溶解后易产生红色的氢氧化铁沉淀4,、有机物（扩大,50,倍,500ml,）,有机物,甘氨酸,,VB1,,VB6,,烟酸,,肌醇,注意：,有机物中的物质均采用托盘天平和电子天平,,称取5,、激素母液（常用的）,生长素,NAA,，,IBA,，,,2,4-D,，,IAA,细胞分裂素,6-BA,，,KT,，,,GA,，,ZT,注意：,这些激素配制时，一般配成,1mg/ml,，,NAA,、,IBA,、,IAA,一般可先用少量,95%,酒精助溶。
2,，,4-D,可用,0.1mol,／,L,的,NaOH,或,KOH,助溶，细胞分裂素类一般先用少量,1mol,／,L,盐酸溶解6,、母液的保存,,,(1),装瓶,:,将配制好的母液分别倒入瓶中，贴好标签，在标签上注明母液名称，配制倍数，与配制日期2,）储藏,： 母液配好后放人冰箱内,4℃,低温保存，用时再按比例稀释二、培养基的配制,1,、用具器材：,粗天平、塑料量杯、烧杯、量筒、移液管、三角瓶、玻璃棒、药勺、,PH,试纸（）、橡皮吸球、吸水纸、羊皮纸等2,、药品试剂：,蒸馏水、蔗糖、琼脂、,1mol/L NaOH,、,1mol/L HCL,、各种培养基母液,（一）实验用品,,（二）培养基配制（以,1L,百合继代培养基为例）,,1,、培养基配方,：,MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.2mg/L+3%,蔗糖,+0.8%,琼脂,2,、配方成分计算：,大量元素（,扩大,10,倍配,1L,）,,微量元素,（扩大,100,倍配,1000ml,）,,有机物,（扩大,50,倍配,500ml,）,,铁盐,（扩大,100,倍配,1000ml,）,,6-BA(0.5mg/ml),,NAA(0.1mg/ml),,蔗糖,,琼脂,,,,,100ml,,10ml,,10ml,,10ml,,3ml,,2ml,,30g,,8g,3,、配制步骤,混合,溶化琼脂（,600-700ml,）,,,母液的量取,加蔗糖,溶解,,液,定容（,1L,）,调,PH,（,5.8,）,分装,1.,量取前先检查母液并摇动,,2.,量母液前,,,移液管和量筒应润洗,,。