胶体金制备 1金免疫技术的特点是以胶体金作为标记物这一技术在 70 年代初期由 Faulk 和 Taylor 始创，最初用于免疫电镜技术迄今为止，金标记仍主要用于免疫组织化学中在免疫测定中，金标记常与膜载体配合，形成特定的测定模式，典型的如斑点免疫渗滤试验和斑点免疫层析试验等，已是目前应用广泛的简便、快速检验方法第一节 免疫胶体金的制备一、 胶体金的特性和制备（一）胶体金的结构胶体金（colloidalgold）也称金溶胶（goldsol） ，是由金盐被还原成原金后形成的金颗粒悬液胶体金颗粒由一个基础金核（原子金Au）及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子（AuC12－） ，外层离子层 H+则分散在胶体间溶液中，以维持胶体金游离于溶胶间的悬液状态胶体金颗粒的基础金核并非是理想的圆球核，较小的胶体金颗粒基本是圆球形的，较大的胶体金颗粒（一般指大于 30nm 以上的）多呈椭圆形在电子显微镜下可观察胶体金的颗粒形态二）胶体金的特性1．胶体性质胶体金颗粒大小多在 1～100nm，微小金颗粒稳定地、均匀地、呈单一分散状态悬浮在液体中，成为胶体金溶液胶体金因而具有胶体的多种特性，特别是对电解质的敏感性。
电解质能破坏胶体金颗粒的外周永水化层，从而打破胶体的稳定状态，使分散的单一金颗粒凝聚成大颗粒，而从液体中沉淀下来某些蛋白质等大分子物质有保护胶体金、加强其稳定性的作用2．呈色性微小颗粒胶体呈红色，但不同大小的胶体呈色有一定的差别最小的胶体金（2～5nm）是橙黄色的，中等大小的胶体金（10～20nm）是酒红色的，较大颗粒的胶体金（30～80nm ）则是紫红色的根据这一特点，用肉眼观察胶体金的颜色可粗略估计金颗粒的大小3．光吸收性胶体金在可见光范围内有一单一光吸收峰，这个光吸收峰的波长（λmax）在 510～550nm 范围内，随胶体金颗粒大小而变化，大颗粒胶体金的 λmax 偏向长波长，反之，小颗粒胶体金的λmax 则偏于短波长，表 19-1 所列为部分胶体金的 λmax三）胶体金的制备1．制备方法胶体金的制备多采用还原法氯金酸（HauC14）是主要还原材料，常用还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等根据还原剂类型以及还原作用的强弱，可以制备0.8nm～150nm 不等的胶体金最常用的制备方法为柠檬酸盐还原法具体操作方法如下：（1）将 HauC14 先配制成 0.01％水溶液，取 100ml 加热至沸。
2）搅动下准确加入一定量的 1％柠檬酸三钠（Na3C6H5O7•2H2O）水溶液3）继续加热煮沸 15min此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成红色全过程约 2～3min4）冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积用此法可制备 16～147nm 粒径的胶体金金颗粒的大小取决于制备时加入的柠檬酸三钠的量表 19-1 列举制备 4 种不同粒径胶体金时柠檬酸三钠的用量四种粒径胶体金的制备及特性胶体金粒径（nm） 1％柠檬酸三钠加入量（ml）* 胶体金特性 （呈色 λmx ）16 2.00 橙色 518nm 24.5 1.50 橙红 522nm 41 1.00 红色 525nm 71.5 0.70 紫色 535nm *还原 100ml 0.01％HauC14 所需量2．注意事项（1）氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。
2）氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制氯金酸水溶液时，不应使用金属药匙称量氯金酸3）用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三蒸馏水，或者是高质量的去离子水4）是以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁的，用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净最好是经硅化处理的，硅化方法可用 5％二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡数分钟，用蒸馏水冲净后干燥备用5）胶体金的鉴定和保存：胶体金的制备并不难，但要制好高质量的胶体金却也并非易事因此对每次制好的胶体金应加以检定，主要检查指标有颗粒大小，粒径的均一程度及有无凝集颗粒等肉眼观察是最基本也是最简单和方便的检定方法，但需要一定的经验良好的胶体金应该是清亮透明的，若制备的胶体金混浊或液体表面有漂浮物，提示此次制备的胶体金有较多的凝集颗粒在日光下仔细观察比较胶体金的颜色，可以粗略估计制得的金颗粒的大小当然也可用分光光度计扫描 λmax 来估计金颗粒的粒径结制备的胶体金最好作电镜观察，并选一些代表性的作显微摄影，可以比较精确地测定胶体金的平均粒径胶体金在洁净的玻璃器皿中可较长时间保存，加入少许防腐剂（如0.02％NaN3）可有利于保存保存不当时会有细菌生长或有凝集颗粒形成少量凝集颗粒并不影响以后胶体金的标记，使用时为提高标记效率可先低速离心去除凝集颗粒。
二、 免疫金的特性和制备（一）免疫金的特性胶体金可以和蛋白质等各种大分子物质结合，在免疫组织化学技术中，习惯上将胶体金结合蛋白质的复合物称为金探针用于免疫测定时胶体金多与免疫活性物质（抗原或抗体）结合，这类胶体金结合物常称为免疫金复合物，或简称免疫金（immunogold） 胶体金与蛋白质结合的机制尚有十分清楚，一般认为是物理吸附性的胶体金颗粒带有一层表面阴性电荷，与蛋白质表面的阳性电荷通过静电感应相附因此环境 pH 和离子强度是影响吸附的主要因素，其他如胶体金颗粒的大小、蛋白质的分子量及蛋白质浓度等也会影响蛋白质的吸附二）免疫金的制备1．用 0.2mol/LK2CO3 或 0.1mol/LHC1 调节胶体金溶液的 pH 至选定值原则上可选择待标记蛋白质等电点，也可略为偏碱但通常最适反应 pH 往往需经多次试验才能确定 在调节胶体金的 pH 值时应注意，胶体金会阻塞 pH 计的电极，不可直接将电极插入胶体金溶液中，宜先用终浓度为 0.15 的聚乙二醇（PEG，20000）稳定胶体金后，再胶体金的 pH 值2．将 1/10 体积的合适浓度的蛋白质溶液加于胶体金溶液中，放置室温反应 2～5min。
由于盐类成分能影响胶体金对蛋白质的吸附，并可使胶体金聚沉，因此待标记蛋白质溶液若含有较高的离子浓度，应在标记前先对低离子强度的蒸馏水透析去盐3．加入浓度为 0.2％的 PEG 或 BSA 以饱和游离的胶体金4．离心分离，去除上清液中未结合的蛋白质离心条件视胶体金颗粒的粒径而异：对 5nm 金颗粒可选用 40000r/min 离心 1h；8nm 金颗粒用 25000r/min 离心 45min；14nm 金颗粒用 25000r/min 离心30min，40nm 金颗粒用 15000r/min 离心 30min5．轻吸上清液沉淀用含 PEG 或 BSA 的缓冲液悬浮，恢复原体积后再离心如此洗涤 2～4 次以彻底除去未结合的蛋白质6．免疫金复合物最终用稀释液配制成工作浓度保存稀释液通常是加入稳定剂的缓冲液缓冲溶液常用中性的 PBS 或 Tris 缓冲液多种蛋白质、葡聚糖、PEG2000、明胶等均为良好的高分子稳定剂，PEG 和 BSA 是最常用的稳定剂稳定剂有两大作用：一为保护胶体金的稳定性，使之便于长期保存；二为防止或减少免疫金复合物的非特异性吸附反应稳定剂的合理选择是十分重要的，不适当的稳定剂有时也会导致非特异性反应。
一、 胶体金即金的水溶液，它也具有一般溶胶的特性分散体系的分类：体系就是一定空间范围内作为我们研究对象的物质，某一种或几种物质分散到另一种物质中所组成的体系叫做分散体系被分散相质点的大小而改变，因此，按分散相质点的大小不同，可将分散体系分为三类一）离子分散体系指分数散相以小分子或离子状态分散着这种溶液具有高度稳定性，无论放置多久，分散相颗粒都不会因重力而下沉，不会从溶液中分离出来（二）胶体分散体系是指分散相颗粒在 1～100nm 之间的分散体系叫做胶体分散系胶体溶液外观透明不浑浊，在普通显微镜下看不见它的分散相粒子，不易受重力影响与分散介质分离沉降，但其中的溶胶粒子有聚结变大的倾向，即具有聚结不稳定性三）粗分散体系分散相颗粒是由许多分子组成，因粒子较大，用肉眼或显微镜即可看见，不稳定，极易因重力而自动沉降，外观浑浊不透明二、胶体金的一般性状（一）胶体金的颜色溶胶的颜色决定于分散相物质的颜色、分散相物质的散度和入射光线和种类，是散射光还是透射光，粒子越小，分散度越高，则散射光的波长越短，对同一种物质的水溶胶来说，粒子大小不同，颜色亦不同，胶体金颗粒在 5～20nm 之间，吸收波长 520nm，呈葡萄酒红色，20～40•nm 之间吸收波长 530nm，液体为深红色，60nm 的金溶液主要吸收波长 600nm，金溶液呈兰紫色，若离心去掉较大的金颗粒，溶胶呈红色。
二）胶体金的稳定性溶胶的稳定性介于小分子离子溶液和粗分散系之间，溶胶的颗粒作布朗运动，不易受重力影响下沉然而溶胶又是不稳定体系，它的胶粒溶剂化作用很弱，总表面积较大，当胶粒相互碰撞时，有自动合并为较大、较重的颗粒倾向胶体颗粒变大以致超出胶体范围而从介质中沉淀出来的现象叫聚沉影响溶胶稳定性的主要原因有三点：①胶粒间的相互吸引力当胶粒相距很近时，这种吸引力可能导致胶粒合并变大②胶粒及其溶剂化层（溶剂是水就是水化层）的带电情况一种溶胶的各个胶粒都带有相同的电荷同性电荷相斥，双电层愈厚，胶粒带电量愈大，排斥力愈大，愈能阻止胶粒合并聚结，溶胶愈稳定③胶体界面的溶剂膜，当二固体间夹有一厚层液体时，这层液体膜有一个反抗二固体接近的排斥力两个胶粒要进一步接近，只有克服它们之间的溶剂化膜的斥力才有可能，因此溶剂膜的斥力是使溶胶稳定的原因之一三）溶胶的聚沉现象胶粒之间存在吸引力与排斥力这对矛盾，在溶胶颗粒带电及溶剂化的情况下，排斥力成为矛盾的主要方面，溶胶稳定而不聚沉因为某种原因使溶胶颗粒带电量减到很小甚至中和；其所带电荷并能去溶剂化膜，胶粒之间可在更近的距离互相接近，引力成为主要矛盾，引力超过斥力时胶粒便聚结发生聚沉。
引起溶胶聚沉的原因有：1．少量电介质对溶胶的聚沉作用 少量电介质即可使溶胶聚沉，但各种电介质的聚沉能力可用聚沉值来表示，聚沉值愈小，聚沉能力愈大，聚沉值从实验中得出如下的离子价规则：①电介质负离子对带正电的溶胶起主要聚沉作用，正离子对带负电的溶胶起主要聚沉作用②同价离子聚沉能力几乎相等，不同价离子的聚沉能力随离子价的增加而显著增加电介质为什么能使溶胶聚沉呢？这是由于电介质与胶粒带相反电荷的离子的作用，中和了胶粒所带的一部分电荷，使胶粒电荷量减少，扩散层缩小，溶剂化层变薄，而当双电层厚度缩至很小的溶剂化层变得很薄时，两个胶粒间便可以更加接近即不产生斥力，两个胶粒间因引力加大而合并的趋势增强，甚至引力占绝对优势以致使胶粒聚结而发生聚沉胶粒的双电层结构见图 5 2．温度对溶胶稳定性的影响 一般影响不大，当温度升高时，吸附能力减弱，溶剂化程度降低，溶剂化层变薄，胶粒聚结，不稳定性增加 3．浓度对溶胶的稳定性的影响浓度增大时，粒子间距离缩小，引力增加，容易聚结而发生聚沉，所以制备比较稳定的溶胶，要有一定的合适浓度第三节胶体金的制备技术胶体金溶液的制备有许多种方法，其中最常用的是化学还原法，基本的原理是向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子变成金原子。
目前常用的还原剂有：白磷、乙醇、过氧化氢、硼氢化钠、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等，下面分别介绍制备不同大小颗粒的胶体金溶液一、 制备胶体金的（一）玻璃器皿的清洁制备胶体金的成功与失败除试剂因素以外玻璃器皿清洁。