精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询汉滩病毒西安分离 84FLi 的 M 片段全基因序列测定及分析作者：李新红 杨为松 杭长寿 白雪帆 马本江 黄长形 李光玉 【关键词】 汉滩病毒 关键词: 汉滩病毒;84FLi 株;序列分析;系统发生树 摘 要:目的 测定我国肾综合征出血热患者流产胎儿肝脏分离病毒 84FLi 株的全 M 片段基因序列，了解其分子基础. 方法 采用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR） ，分节段扩增 M 基因片段的 cDNA，直接用 PCR 产物或克隆入 pMD18-T 载体后进行测序. 结果 84FLi 株的全M 基因序列组成为:M 片段基因共由 3616 个核苷酸组成，四种核苷酸的比例分别为 A30.92%，C18.03%，G21.18%，T29.87%.GC 含量为39.21%，AT 含量为 60.79%.最大开放读码框为 41～3448，共编码1135 个氨基酸.核苷酸序列同源性分析表明 84FLi 株与 HTN 型同源性高于与其他型汉坦病毒的同源性，其中与中国株的同源性较高，与 HV114 株的同源性为 85.5%.与 HTNV 的国际标准毒株 76-118 的核苷酸同源性分别为 84.0%，氨基酸的同源性为 96.0%. 结论 84FLi株属于汉滩型病毒，并与分离自国内的汉滩病毒同源性较高. Keywords:hantaan virus;strain84FLi;sequence analysis;phylogenetic tree 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询Abstract:AIM To study the complete M segment sequence of84FLi，a Hantaan virus isolated from a fetal liver in Xi’an and to explore its molecular characters.METHODS The cDNA of M segment was amplified fragment by fragment us-ing RT-PCR.The purified PCR products were sequenced di-rectly or cloned into pMD18-T vector and then sequenced.RESULTS The complete M segment of84FLi strain was composed of3616nucleotides with a single open reading frame，extending from41to3448encoding1135amino acids.Homology analysis showed that the homology of84FLi M segment nucleotide sequences with HTN isolates，especially Chinese isolates，was higher than that of other Hantavarises，for example，85.5%nucleotide sequences with HV114（iso-lated in China） ，while only84.0%with76～118（HTN for-eign standard strain）.The amino acid homology between the two strains was96.0%.CONCLUSION The results sug-gest that Strain84FLi is one of the Hantaan virus，which is highly related to other Chinese Hantaan virus isolates. 0 引言 精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询汉坦病毒（hantavirus，HV）属于布尼亚病毒科汉坦病毒属，人类感染可导致两种严重的疾病:肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syn-drome，HFRS）和汉坦病毒肺综合征（hantavirus pulmonary syndrome，HPS）.病毒有包膜，其基因组是一个单链含大（L） 、中（M）和小（S）三个基因片段的负链RNA，编码的结构蛋白分别为 L 蛋白（即依赖 RNA 的 RNA 多聚酶） 、包膜糖蛋白（G1，G2）和核衣壳蛋白（NP） ［1，2］ .病毒的中和抗原位点、血凝抗原位点、型特异性位点和毒力位点等均位于包膜糖蛋白上，故测定 M 片段的核苷酸序列将有助于了解病毒致病性的分子基础［3-5］ ，同时 M 基因构建的系统发生树还可以用来做病毒分型.84FLi 株是杨为松等于 1984 年从肾综合征出血热患者流产胎儿的肝脏中分离的毒株［6］ ，经空斑减少中和试验和 M 片段部分基因序列分析鉴定为汉滩病毒型（hantaan virus，HTNV） ［7］ .该毒株是中国预防医学科学院病毒学研究所研制的双价灭活疫苗（Ⅰ型）的生产株，所制备的疫苗已被批准正式生产.测定该毒株的 M 片段基因组序列将有助于了解其分子基础，从而更进一步研究其生物学特性以及致病机制. 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 病毒株 汉滩病毒 84FLi 株系由杨为松等从胎儿脏器中分精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询离，由病毒所保存. 1.1.2 引物设计及合成 参照汉滩病毒国际标准毒株 76-118 的 M片段核苷酸序列［1］ 设计用于 PCR 扩增的引物（Tab1） ，由大连TaKaRa 公司和上海 BioAsia 公司合成.P2 和 P3 由卫生部生物制品检定所姚智慧副研究员提供. 表 1 cDNA 合成及 PCR 扩增引物 略 1.1.3 其他试剂 cDNA 合成试剂盒及 ELON-GASE DNA 聚合酶购自Gibco Brl 公司. 1.2 方法 1.2.1 病毒 RNA 提取 病毒以常规接种 Vero 细胞.用 IFA 法检测细胞感染程度.待细胞荧光出现～（75%～100%细胞有感染病毒颗粒）时收获病毒，用于提取病毒 RNA.病毒感染细胞总 RNA 的提取按照Gibco Brl 公司的 TRIZOL 试剂盒操作说明进行. 1.2.2 cDNA 合成 以 PCR 扩增正向引物 S1 作为反转录引物，采用 Super scripTMⅡ逆转录酶合成 cDNA 第一链. 1.2.3 PCR 扩增及克隆 以 cDNA 为模板，分节段扩增 M 基因片段.精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询PCR 产物于 10g L-1 琼脂糖凝胶上电泳分离，用 QIAGEN 公司的快速凝胶提取试剂盒纯化.纯化片段直接用于序列测定或克隆入 TaKaRa公司的 pMD18-T 载体中.克隆用 PCR 和酶切鉴定方法进行初步筛选. 1.2.4 核苷酸序列测定及分析 序列测定在 ABI PRISMTM377XL DNA 自动测序仪上进行，由大连 TaKaRa 公司和上海 BioAsia 公司完成.用 DNAstar 和 Clustlw 软件进行核苷酸序列和氨基酸序列的同 源性和系统发生分析. 2 结果 2.1 84FLi 株 M 片段核苷酸序列 84FLi 株 M 片段基因共由 3616个核苷酸组成，四种核苷酸的比例分别为A30.92%，C18.03%，G21.18%，T29.87%.GC 含量为 39.21%，AT 含量为 60.79%.最大开放读码框为 41-3448，共编码 1135 个氨基酸.Mr 126500，等电点为 6.93.M 片段的全基因序列及其推导的编码氨基酸序列 GenBank 注册号为 AF345636.汉坦病毒 M 基因具有布尼亚病毒科其他属共同的特征:即在编码糖蛋白之前有一个先导序列，76-118株的 M 基因 ORF 第 1 个 AUG 之后和成熟的 G1 氨基末端之前有一个18 个氨基酸，构成典型的糖蛋白信号序列［1］ .84FLi 株也不例外，根据氨基酸序列分析，84FLi 株 G1 起始于第 18 个氨基酸，从第40～42 位起始密码子 ATG 至 89～91 位 TGT 编码的 17 个氨基酸的短精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询肽是典型的糖蛋白信号肽序列.G2 起始于第 649 位氨基酸，G1 与 G2之间是一个由 5 个氨基酸残基（WAASA）组成的共翻译切割点，在细胞内质网内将前体大蛋白切割加工成 G1 和 G2 两个蛋白. 上一页 1 2 下一页2.2 汉坦病毒 M 片段序列的同源性和差异性比较 应用 Jotun Hein 方法将 84FLi 株的 M 片段全基因序列与 GenBank 中的其他 29株汉坦病毒的 M 片段全基因序列进行同源性分析，84FLi 株与 HTN型同源性为 74.7%～85.5%，其中与中国株的同源性较高，与 A9 株的同源性为 85.4%，差异性为 16.6%.和其他不同型别汉坦病毒代表株 Seoul80-39，Thai749，Dobrava，CG1820，Bayou 和 Moravia 的M 片段的同源性分别为71.2%，70.4%，70.1%，58.0%，58.2%，58.1%.M 片段氨基酸序列比较结果表明，与 HTN 型间同源性为 84.3～96.0%，与中国株 Z10 和A9 株的同源性分别为 96.0%，95.3%.与 SEO 型的同源性为72.8%～76.4%.与其他型汉坦病毒氨基酸的同源性为53.8%～76.8%，差异性为 38.2%～68.4%. 2.3 系统进化树分析 应用 Jotun Hein 方法进行种系发生分析，构建了 30 株汉坦病毒核苷酸和氨基酸的种系发生树（Fig1）.从基于 M 片段核苷酸序列绘制的系统发生树来看，84FLi 株属于 HTN 型，与 A9、HV114 和 Z10 株等中国 HTN 毒株的亲源关系近于与韩国和日精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询本的 HTN 毒株的关系.这与基于 M 片段氨基酸序列构建的系统发生树结果一致. 图 1 汉滩病素 84FLi 株 M 片段全基因序列的系统发生树 略 3 讨论 汉坦病毒 84FLi 株分离自胎儿肝脏，是在 Vero 细胞上从 16 株汉坦病毒中选育出的汉滩病毒疫苗候选株［8］ .具有适应性好、繁殖力强、免疫原性好和抗原性好等优点.测定其 M 片段全基因序列，了解其分子基础及发病机制，将有助于防治汉坦病毒.梁米芳等应用交叉空斑减少中和试验（cross plaque re-duction neutralization test，cross-PRNT）对其抗原性的血清学分析以及用 M 片段 1984至 2316 位间的 333bp 核苷酸区域序列系统发生树比较分析，结果表明:84FLi 株与 HTN 型毒株间同源性较高，属于 HTN 型病毒［7］ .本研究测定了汉坦病毒疫苗株 84FLi 株的 M 片段的全基因序列，结果发现 M 片段由 3616 个核苷酸组成，四种核苷酸的比例分别为A30.92%，C18.03%，G21.18%，T29.87%.GC 含量为 39.21%，AT 含量为 60.79%.最大开放读码框为 41-3448，共编码 1135 个氨基酸. Xiao 等［9］ 用系统进化分析法（phylogenetic anal-ysis）对 HV 进行了分型.由于两种病毒以共同的祖先分化的年代越久远，在他们的核酸分子中所积累的差异就越大，因而病毒核酸序列的相精品文档欢迎来主页查询更多精品文档,欢迎来我主页查询似程度能反映出病毒之间相似形和亲缘关系，进而可绘制出病毒的系统进化树，以此来比。
