粘质沙雷氏菌脂多糖的提取一、实验目的 1、了解脂多糖（LPS）的生理生化作用及其制品的应用； 2、掌握从粘质沙雷氏菌中提取 LPS 的主要方法 3、掌握真空冷冻干燥机的使用方法 二、实验原理 （一）菌种 粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）曾称灵杆菌，它属于真细菌纲，真细菌目，肠杆 菌科，沙雷氏菌属 它是细菌中最小者，细胞杆状或球状，单个存在或排列成短链，能运动，有 4 条或更 多鞭毛，周身鞭毛，无荚膜，无芽孢革兰氏染色呈阴性 粘质沙雷氏菌为腐生菌，在自然界中分布很广，分布于土壤、水和食品中，也存在于 人的呼吸道、肠道和粪便中所以该菌可自土壤、水、人和动物的粪便中分离得到 该菌属长期以来认为对人体无害，但近来发现粘质沙雷氏菌是条件致病菌，可引起肺 炎、泌尿道感染、呼吸道感染、败血症以及外科术后创伤感染，是医源性感染的重要条件 致病菌 约半数菌株能产生红色的灵菌素，多次传代后产生色素的能力减弱，甚至消失 （二）灵菌素 灵菌素是由粘质沙雷氏菌菌体中提取的脂多糖 LPS 一方面可视为革兰氏阴性菌的致病因子，因而在革兰氏阴性菌感染的发病机理中 起着十分重要的作用，另一方面 LPS 对机体亦可表现出显著的有益作用：能激活脑下垂 体——肾上腺皮质系统，调整机体内部环境与功能，增强机体对外界环境变化的适应能力， 刺激机体产生抗体，使白细胞总数增加，吞噬功能加强，激活机体防御系统，抗御病原微 生物及病毒的侵袭。
同时它还具有抗菌抑癌，提高免疫力等生理活性功能 （三）LPS 的提取方法 目前从粘质沙雷氏菌中提取脂多糖的方法有很多，主要有三氯乙酸-乙醇冷提法、盐析 法、热水提取法和热酚水法 先用三氯乙酸、稀醋酸或酚将其提出，再纯化 三、仪器和药品 1、仪器与器皿 离心机、天平、恒温培养箱、摇床、水浴锅、冻干机、湿热灭菌锅三角瓶（50 ml、250 ml） 、离心管、玻璃棒、烧杯、可调式移液器（1000-1000 μl、1-5 ml） 、可调式 移液器枪头 广泛 pH 试纸、塑料布、透析袋 2、药品 牛肉提取物、蛋白胨、NaCl、琼脂、蒸馏水、生理盐水、苯酚、无水乙醇、 NaHCO3、EDTA 四、实验步骤 1、菌种培养 （1）斜面培养基培养 将营养肉汁琼脂培养基[（g/L）：（蛋白胨 10.0，牛肉提取物 3.0，NaCl 5.0，琼脂 15.0，pH 值 7.0 左右）]制作成斜面培养基，将菌种接种在斜面培养基上，28 ℃恒温培养 24～48 h2）发酵培养基培养 制作营养肉汁培养基分装于三角瓶中，28 ℃恒温 160～170 r/min 摇床培养 24～48 h 2、热酚水法提取灵菌素 （1）将深层发酵后获得的菌体以 10,000 r/min 离心 8 min，收集菌体。
（先称量一下 离心管的质量） （2）将菌体悬浮于蒸馏水中（每 1g 细菌加 3ml 蒸馏水进行悬浮） ，-40 ℃冰箱反复冻 融 2~3 次效果比较好 （3）再加热至 60 ℃，在热细胞悬浮液中加入等体积预热至 50 ℃的 90 %（w/w）苯 酚溶液，于 68～72 ℃水浴中搅拌保温 30 min 后，冷至室温 （4）4 ℃冰箱中过夜 （准备实验：处理透析袋 100 ℃ 煮 30 min）/// （5）然后 7,000 r/min 离心 10 min，取水相 （6）将水相溶液装于透析袋中，流水透析 24 h 去酚/// （7）再用蒸馏水透析 48 h，每天换水数次 （8）将透析袋中的液体装入能预先称重的冻干瓶中，-40 ℃冰箱冻成冰后，置于冻干 机中冷冻干燥，得脂多糖粗制品 （脂多糖在制成干品前还是后进行除菌由同学选择，并 进行相应的操作） 并做脂多糖抑菌实验的准备工作：找出使用的仪器、试剂及器皿、配制培养基等等， 并设计实验操作步骤 ）/// 3、由学生利用学过的知识设计并进行脂多糖抑菌实验/// 观察结果，写一份实验报告五、实验结果 1、根据实验结果计算出 LPS 的产率 2、写出 LPS 的抑菌效果。
六、思考题 1、在细菌悬浮于蒸馏水之后，为什么最好反复冻融 2-3 次？ 2、制备好的 LPS 如果暂时不用，应该怎样保存？ 。