流式细胞仪工作原理流式细胞仪工作原理 流式细胞术的原理流式细胞术的原理•流式细胞术（FCM）是一种能对单个细胞、分子和生物颗粒（微生物）进行多参数快速检测的新型分析和分选技术近几年随着多种单克隆抗体的成功制备和多种荧光素的应用FCM逐步运用于对疾病诊断和治疗监测的临床检验常规工作 流式细胞仪与显微镜流式细胞仪与显微镜光源激光自然光、灯光、氙(汞)灯对象细胞、生物粒子细胞、生物粒子承载工具载(盖)玻片鞘液及流动室检测信号 光学信号形态及染色放大方式PMT，放大电路目镜X物镜统计人工，200计算机，>5000结果简单，单参数多参数，综合分析 基本原理流路•流动室 •鞘液SHEATH •样本流SAMPLE 单细胞悬液5*105~1*106个/ml光路•光源•检测信号•光电倍增管PMT HV电路•放大电路HV及GAIN 增益•A/D转换•统计：计算机 流式细胞仪流式细胞仪光路光路流路流路电子电子软件软件 流路流路光路光路电路电路/电子电子软件软件 流流 路路• 单细胞悬液• 大多数仪器是在50-300 µm 大小的孔径中,将细胞悬液注射进入鞘液中 •这一过程,成为流体动力学聚焦 FLOW CELLInjector TipFluorescencesignalsFocused laserbeamSheath fluid 流路流路光路光路电路电路/电子电子软件软件 光光 路路光源光源检测信号检测信号 散射光信号散射光信号FS: 前向角散射光前向角散射光SS: 侧向角散射光侧向角散射光(90度散射光度散射光) 荧光信号荧光信号荧光染料荧光染料光学滤片光学滤片 颜色补偿颜色补偿 光光光光 路路路路•光源与通过的细胞聚焦在同一点上 • 激光 空冷 488nm blue, 633nm red, 325nm UV, 514nm green,水冷Innova300系列Innova70系列固态 检测信号检测信号 散射光信号散射光信号散射光信号散射光信号——前向散射光前向散射光前向散射光前向散射光( ( ( (FS)FS)FS)FS)•FS----Forward (Angel Light) Scatter在激光束正前方的检测器, 为前向散射光检测器 •FS的强度与细胞或其他颗粒的大小, 形状及 optical homogeneity 有关•FS用于检测细胞或其他粒子的表面属性如:大小 前向散射光前向散射光 散射光信号散射光信号 – – 侧向散射光侧向散射光•SS-Side (Angel Light) Scatter 与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器, 也称为90度散射光检测器• SS的强度与细胞或其他颗粒的大小, 形状及 optical homogeneity 有关•SS用于检测细胞内部结构如:胞浆内颗粒多少, 核质比 侧向散射光侧向散射光 90 Degree Scatter0 200 400 600 8001000815203040501002001000LymphocytesMonocytesNeutrophilsSide Scatter ProjectionLight Scatter GatingScale 光路光路- -荧光信号荧光信号•每种荧光染料均有特定的激发波长, 并激发后会有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长. • 利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测)这些光学信号 荧光染料的特性荧光染料的特性•激发波长(EXCITING)•发射波长(EMISSION) Fluorescence emitted by each fluorochrome is usually detected in a unique fluorescence channel.The specificity of detection is controlled by the wavelength selectivity of optical filters and mirrors. Absorption spectrum:Range over which a fluorescence pound may be excitedEmission spectrum:Range of emitted wavelengths for a particular pound 5 Color Single Laser (488nm)FITC/PE/ECD/PC5/PC7 4 Color Single Laser (488nm)FITC/PE/ECD/PC5 常用荧光染料的特性荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途 颜色FITC 488 525 免疫荧光 绿色PE(RD1) 488 575 免疫荧光 橙色 ECD 488 620 免疫荧光 橙红PeCy5 488 675 免疫荧光 红PI 488 620 DNA染色 橙红PECy7 488 755 免疫荧光 深红PerCP 488 670APC 633 670 光路光路 - - 滤片特性滤片特性• 当以 45o 角放置滤片时,该滤片可以通过一定波长的光,同时也可以阻断并折射该波长以下的光 •这种方式的滤片称为二向色性滤片( dichroic filter) 标准带通滤片标准带通滤片 band pass 光源光源通过的光谱通过的光谱630/30 nm BP615-645 nm light SourcelightPassedlightCertain colorsabsorbedAbsorbancefilter 488 DL488 BK550 DL525 BP600 DL575 BP640 DL620 BP675 BP Unique 4-Color Single Laser DesignAir-cooled Argon Ion LaserBeam Shaping LensesHigh SensitivityQuartz Flow CellForward ScatterDetectorSide ScatterDetector525BP FL1 (FITC)575BP FL2 (RD1)620BP FL3 (ECD)675BP FL4 (PC5)488DL488BK550DL600DL645DL PC7Air-cooled Argon Ion LaserBeam Shaping LensesHigh SensitivityQuartz Flow CellForward ScatterDetectorSide ScatterDetector525BP FL1 (FITC)575BP FL2 (RD1) 675BP(PC5)750BP FL4 (PC7)488DL488BK550DL600DL 700DL With Thanks to Dr. Frank SchniedersGentherapie Gruppe – Abteilung Molekulare Zellbiologie Institut für Medizinische Biochemie und MolekularbiologieUniversitätsklinikum Hamburg-EppendorfEGFP, EYFP and 7-AADWith EPICS® XLTM and EXPO32TM ADC-SoftwareHEK293Human EmbryonalKidney Cells 293Filter SetBP 510LAF21BP 550LAF30Dichroic Mirror 525DRLPCell Viability with 7-AADHEK293-cells with EYFP TransfectionHEK293-cells with EGFP TransfectionMixture of EGFP- and EYFP-transfected HEK293-CellsEGFP ... Enhanced Green Fluorescent Protein (Ex 488; Em 507 nm)EYFP ... Enhanced Yellow Fluorescent Protein (Ex 513; Em 527 nm)7-AAD ...7-Aminoactinomycin (Viability Stain ; Ex 546; Em 647 nm) emission intensitywavelengthFLBFLA颜色补偿 减法颜色补偿•减法补偿–去除叠加信号,在使用双色以上时会产生减得过多的错误 –BD FACSCalibur–补偿试剂FITCPECorrectCorrectOver-pOver-pFITCPEUnder-pUnder-pFITCPE 全矩阵颜色补偿•全矩阵–在每个PMT上对于每一个荧光计算 “叠加荧光素” 的比率–通过矩阵去除或加上信号•EPICS XL•Cytomics FC500•Gallios/NaviosCD45-ECD 流路流路光路光路电路电路/电子电子软件软件 电路及电子系统电路及电子系统- -光电倍增管光电倍增管–Photomultiplier tube (PMT)• 将光学信号转变为电脉冲(数字数据)信号 不同的脉冲信号被转换成数字通道不同的脉冲信号被转换成数字通道(CHANNEL)的过程的过程 单参数直方图单参数直方图 流路流路光路光路电路电路/电子电子软件软件 软件•基于Windows 平台•软件界面简单，易学易用•目前流式获取和分析最友好的软件包，涵盖所有数据和图形处理功能•易于与医院内LIS系统相连•直观拖拽方式调节电压、补偿，支持时时/自动/脱机补偿•支持多文件分析报告，内置FlowPage功能，方便中文临床报告的生成和输出•PRISM浓缩柱形图功能便于结果统计，兼容Office，支持PDF•内置质控功能 Quickset——直观的电压调节 QuickComp——直观的补偿调节补偿前补偿前补偿后补偿后 PRISM浓缩柱形图• 一张图上显示多达1024个表型组合结果（十色分析，210分析组合）• 将实验所分析的所有细胞数据结果简单地浓缩在一张直方图上• 能直接读出各种阴性或阳性组合的结果• 清晰直观且便于数据的保存颜色点图组合2122332346245102561526721271045210 •直接打印或输出PDF格式•FlowPage打印页上的图形和软件工作区中的图形同步，当您拖拽一个新的数据到工作区时，打印页中的图形也会随之自动更新便捷的FlowPage中文模板报告功能 PPTExcelword数据输出方式灵活-兼容Office系统•强大的数据兼容性，直接输出至Word、Excel、PPT中 强大的兼容性，易于与医院LIS系统相连 。