谈谈多粘类芽孢杆菌！ 摘 要: 多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)对人或动植物没有致病性,某些菌株可产生如抗 生素、拮抗蛋白、植物激素、酶、絮凝剂等多种生物活性物质这些活性物质在植物病害防治以 及人和动物疾病治疗方面具有诱人的应用前景本文对近年来多粘类芽孢杆菌及其产生的生物活 性物质的研究进展进行了综述 关键词: 多粘类芽孢杆菌, 生物活性物质, 抗生素, 抗菌蛋白, PGPR 1994年, Ash等在分子生物学研究结果的基础 上建立了类芽孢杆菌属 , 并将多粘类芽孢杆菌 (Paenibacillus polymyxa)立为类芽孢杆菌属的模式 菌种多粘类芽孢杆菌是少数能够产生具有临床应 用价值的抗生素的细菌之一, 由它产生的多粘菌素 B(polymyxins B, PMB)和多粘菌素 E(colistin)已在临 床上用于抗细菌感染其中的某些菌株也是重要的 植物生防细菌和植物根际促生菌 (plant growth- promoting rhizobacteria, PGPR), 并且在农业领域已 得到广泛的应用此外, 多粘类芽孢杆菌及其代 谢产物在工矿业及废水处理方面也有应用。
由于 其诱人的应用前景, 美国环保署(EPA)将它列为可 商业上应用的微生物之一, 我国农业部也将其列为 免做安全鉴定的一级菌种1、多粘类芽孢杆菌的分类地位 多粘类芽孢杆菌原名多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa), 以形态学为分类基础, 早期研究将其归入芽孢杆菌属1994 年, Ash 等[1]通过 PCR 探针试 验分析了几株芽孢杆菌的 16S rRNA 序列, 分析显 示芽孢杆菌至少包括五种系统发生线, 并发现一些 芽孢杆菌与其他芽孢杆菌的表型特征差异极大, 16S rRNA 序列存在高度特异性在此研究结果的基础 上, Ash 将多粘芽孢杆菌等 11 个种从芽孢杆菌属中 分离出来, 另立类芽孢杆菌属, 并将多粘类芽孢杆 菌立为类芽孢杆菌的模式菌种, 至今类芽孢杆菌已 有 23 个种多粘类芽孢杆菌细胞呈杆状, 革兰氏染 色阳性、阴性或可变, 接触酶阳性, 氧化酶反应可变, 厌氧条件下所测定的大多数菌株固定氮2、多粘类芽孢杆菌产生的生物活性物质 多粘类芽孢杆菌可产生多种生物活性物质, 如 酶、抗菌物质、植物激素以及絮凝剂等, 这些活性 物质大多为蛋白质、多糖、多肽等多粘类芽孢杆 菌产生的抗菌物质按其物质类型及分子大小可分为 小分子的多肽抗生素类、大分子的拮抗蛋白(酶)类 等。
这些抗菌物质性质比较稳定, 如耐高温、高压, 对酸碱稳定, 对蛋白酶不敏感等2.1 多肽抗生素类 多肽抗生素是多粘类芽孢杆菌产生的一类非核 糖体肽类抗生素, 结构多种多样, 有线状、环状和线 环状, 分子中常含有一些特殊的基团, 如乙醇胺、亚 精胺、2,4 一二氨基丁酸和甲酰基等与抗菌蛋白相 比多肽抗生素分子量较小, 一般在 1 kD~2 kD 之间 多粘菌素(polymyxins)是多粘类芽孢杆菌产生 的一类碱性线环状阳离子多肽抗生素, 含有疏脂性 和亲脂性基团及一个多肽尾, 图 1 为多粘菌素的结 构示意图根据结构差异将其分为多粘菌素 A、B、 C、D 和 E 等组分, 分子量都在 1200 D 左右多粘 菌素(polymyxins) A-E 具有相似的抗菌谱, 对多种 革兰氏阴性菌具有强烈的杀菌作用, 研究表明, 多 粘菌素(polymyxins)可破坏革兰氏阴性细菌细胞质 膜的通透性, 致使胞内物质泄漏从而起到杀菌作 用由于多粘菌素 B(polymyxins B, PMB)不仅对多 种革兰氏阴性细菌具有杀菌作用, 而且对如革兰氏 阴性菌的内毒素(LPS)等细菌的致病因子具有明显 的拮抗作用, 因而越来越引起人们的重视。
多粘菌 素 B 具有肾毒性和神经毒性, 一度限制了它在临床 上的应用, 但是, 由于临床上多药耐药(multidrug resistance MDR)革兰氏阴性杆菌等缺乏有效的治疗药物, 以及多粘菌素 B 九肽(polymyxin B nonapep- tide)(采用酶裂解 PMB 后得到的毒性降低但保留了 抗内毒素活性的 PMB 衍生物) 的出现, 使 PMB 又 重新受到人们的重视多粘菌素 E(colistin)是一种狹 效性抗生素, 虽然其抗菌效果较 PMB 差, 但是它毒 性小、副作用低, 因此, 它在禽畜的临床应用上较 PMB 多, 目前已广泛应用于禽畜的饲料添加剂Fig. 1 Structure of polymyxins Fusaricidins 是一类从多粘类芽孢杆菌中分离的 由六个氨基酸残基和一个 2-胍基-3-羟基十五烷酸 (GHPD)组成的环状多肽类抗生素, 图 2 为 Fusa- ricidins 的结构示意图它包括 Fusaricidins A-D 几 种结构类似的组分Fusaricidins 对尖孢镰刀菌 (Fusarium oxysporum)、黑曲霉(Aspergillus niger)、 米曲霉 (Aspergillus oryzae) 、黄海葵附生真菌 (Penicillium thomii)等具有很好的拮抗作用, 对白色 念珠菌 (Candida albicans) 、酿酒酵母菌 (Saccharomyces cerevisiae)具有显著的拮抗作用, 对 金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等革兰氏阳性 细菌具有很高的杀菌活性。
Soo-Keun Choi 等将 多粘类芽孢杆菌 E681(Paenibacillus polymyxa E681) 的培养液离心后, 用甲醇抽提菌体得到 Fusaricidins, 通过液相色谱质谱联用仪分析其氨基酸序列, 并测 定了 Fusaricidins 合成酶的基因序列, 为该抗生素的 工业化生产奠定了基础Fig. 2 Structure of Fusaricidins 另外, 还有多种多肽类抗生素在多粘类芽孢杆 菌的发酵液中被发现Brigitte Pichard 等[9]在多粘类 芽孢杆菌 BP1(Paenibacillus polymyxa BP1)的培养肉汤中分离得到两种新的多肽抗生素, 分别命名为 Gavaserin 和 SaltavalinGavaserin 分子量为 911 D, 含有谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、2,4-二氨基 丁酸以及辛酸Saltavalin 分子量为 903 D, 含有丝 氨酸、丙氨酸、亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸、2,4-二氨 基丁酸, 在这种多肽中没有发现脂肪酸近年来, 又 有多种多粘类芽孢杆菌产生的多肽抗生素被发现, 周华强等用加热法从多粘类芽孢杆菌 LM-3(Paenibacillus polymyxa LM-3)发酵液中纯化 得到一种极端嗜热多肽 APPLM3, 该多肽对稻瘟病 菌有较强的拮抗作用, 且热稳定性相当高。
多粘类 芽孢杆菌产生的多肽抗生素大多为多种组分抗生素, 它们往往是一族对特定病原菌具有很高活性、结构 相似的抗生素, 分子量在 1000 D 左右广告 新型肥料与施肥新技术作者：林新坚，等京东 广告 新型肥料无风险施用100条作者：高文胜，陈宏坤京东 2.2 拮抗蛋白 多粘类芽孢杆菌产生的具有抗菌活性的蛋白质 大多数为核糖体合成的细胞壁降解酶类, 如 β-1,3- 葡聚糖酶、几丁质酶等β-1,3-葡聚糖多聚物是大多 数植物病原真菌细胞壁的主要成分, β-1,3-葡聚糖酶 可水解 β-1,3-葡聚糖中的 β-1,3-糖苷键, 从而抑制植 物病原真菌的生长与增殖同时, β-葡聚糖酶还是一 种极具经济价值的工业用酶可溶性非淀粉多糖是 饲料原料中主要的抗营养因子, 它可增加动物肠道 的粘性从而阻碍对营养物质的吸收, 在饲料中添加 β-葡聚糖酶可水解饲料中的可溶性非淀粉多糖在 啤酒生产中加入 β-葡聚糖酶可解决 β-葡聚糖引起的 大麦难降解、黏度大的问题, 以提高啤酒的质量与 稳定性 包括多粘类芽孢杆菌在内的多种杆菌可产生 β- 葡聚糖酶, 李卫芬等对 1 株多粘类芽孢杆菌产生 的 β-葡聚糖酶特性进行了分析, 克隆了该酶基因的 全长 DNA 序列, 该序列长度为 734 bp, 其中开放阅 读框架长 714 bp, 编码 238个氨基酸, Blast分析结果 显示, 该序列与已经登录的多粘类芽孢杆菌 X5709 (Paenibacillus polymyxa X5709)同源性为 99.04%。
姚 乌兰等通过 DEAE-Sephadex A-50 离子交换层析、 Sephacryl S-200 分子筛层析, 从多粘类芽孢杆菌 WY110(Paenibacillus polymyxa WY110)菌株发酵液 中分离纯化到一种分子量为 26 kD 的蛋白质 P2, 该 蛋白对稻瘟病菌的不同菌株表现出抑菌活性蛋白 质 P2 N-末端 24 个氨基酸测序为 H2N-Ala-Asn-Val- Phe-Trp-Glu-Pro-Leu-Ser-Tyr-Tyr-Asn-Pro-Ser-Thr-Trp-Gln-Lys-Ala-Asp-Gly-Tyr-Ser-Asn-Blast P 检索 结果表明, P2 蛋白与 1 株已报道的多粘类芽孢杆菌 β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因 gluB 同源性为 84％用此 酶的特异底物地衣多糖进行了定性检测, 验证了 P2 蛋白具有 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的活性几丁质是绝大 多数真菌细胞壁的结构物质, 同时还是昆虫中肠围 食膜的主要成分几丁质酶可催化水解几丁质的 β-1,4-糖苷键, 它在植物病虫害的防治方面, 以及在 几丁质废物的转化和利用等方面都具有重要作用。
Mavingui 等从 1 株多粘类芽孢杆菌中分离获得了 具有抗菌活性的几丁质酶人们还发现, 某些多粘 类芽孢杆菌还可产生多种蛋白酶、核糖核酸酶等 多粘类芽孢杆菌还可以产生一些不具酶活性的 拮抗蛋白Saravanakumar Kavitha 等[16]将多粘类芽 孢杆菌 VLB 16(Paenibacillus polymyxa VLB 16)的发 酵液用 40 ％的硫酸铵沉淀 , 沉淀物溶解后经 Sephadex G-200 分子筛层析, 得到一种分子量为 37 kD 的蛋白质, 该抗菌蛋白对稻瘟病菌和丝核菌具有 拮抗作用研究表明, 该拮抗蛋白可作用于病原真 菌的细胞壁及菌丝, 引起细胞形态发生改变, 但未 发现该蛋白具有酶活性傅里叶变换红外光谱仪检 测结果显示, 该蛋白的高级结构主要由无规则卷 曲、β-转角、β-折叠构成, 热稳定性高且对链酶蛋白 酶以及一些蛋白质变性剂不敏感陈雪丽等[17]通过 硫酸铵沉淀、Sephadex G-50 分子筛层析, 在多粘类 芽孢杆菌 BRF-1(Paenibacillus polymyxa BRF-1)发酵 液中分离纯化到一种对大豆立枯丝核菌具有拮抗活 性的抗菌蛋白, 经 SDS-PAGE 检测 BRF-1 抗菌蛋白 的分子量为 35.4 kD, 其结构尚不明确。
2.3 多粘类芽孢杆菌及其产生的其他生物活性物质 多粘类芽孢杆菌产生的多种抗生素和酶已应用 于临床和植病生防除此之外, 多粘类芽孢杆菌还 可以产生植物激素、凝絮剂、表面活性剂等其他生 物活性物质这些物质是多粘类芽孢杆菌作为 PGPR 以及在废水处理、矿物浮选等领域应用的物质基础2.3.1 多粘类芽孢杆菌产生的植物激素：微生物可 产生吲哚乙酸(IAA)、生长素(auxins)、双萜化合物 类的赤霉素(g。