荧光定量PCR,临床应用解读,1,Clinical Application Interpretation of the Fluorescence Quantitative PCR,许泼实,内容提要,一、FQ-PCR技术简介 二、乙型肝炎的病原检测 三、丙型肝炎的病原检测 四、性病相关病原体的检测 五、其他分子生物学项目,2,荧光定量PCR技术,,3,基因诊断与PCR,4,基因诊断：通过核酸的分子生物学检测直接检测基因的存在状态或缺陷对疾病作出诊断 PCR是一种DNA的快速扩增技术，它通过两个引物片段和一种耐热酶，可在短时间内把特定的DNA片段扩增1000万倍 80年代发明PCR，90年代中期PCR临床应用在国内全面开展，98年荧光定量PCR技术开始应用于临床检测荧光定量PCR技术,指在反应体系中加入荧光标记，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程，通过标准曲线对PCR终产物的分析，实现对未知起始模版进行定性和定量的一种技术荧光共振能量转移”,5,,,6,系列标准品所做出来的标准曲线,浓度对数,达到阈值时的循环数,荧光定量PCR技术的优点,特异性强：直接扩增病原体的特异DNA或异常基因片段 灵敏度高：可检测到极少量的DNA，有效降低漏诊率 显著缩短病原体检出窗口期 高效省时：扩增周期短，有利于快速诊断 定量准确：利用标准曲线法，采用对数期分析 取材范围广：血清、痰液、体液、毛发等多种样本 全封闭反应：无需PCR后处理，降低污染 自动化程度高：操作安全，避免人为判断,7,有效减少窗口期漏检，避免“被医院感染” 检出免疫学方法尚无能为力的免疫静默感染、乙肝隐匿性感染、病毒变异株感染等 提高献血员窗口期筛查检出率，降低输血传播病毒风险，进一步保障用血安全 鉴定职业暴露源的传染性及被暴露者的监测周期,缩短病原体检测 “窗口期”,8,我国ELISA漏检远高于国外为什么？,荧光定量PCR技术的临床应用,病毒性肝炎（HBV、HBV-YMDD、HCV） 性病相关病原体（CT、NG、UU、HPV、HIV、TP） 优生优育相关项目：HCMV、HSV-Ⅱ、TOX、RV 其它病原体检测：结核杆菌、肺炎支原体、EB病毒、伤寒杆菌、幽门螺旋杆菌等,10,如何看FQ-PCR测定报告,定量--测定的是量的“多”或“少”；定性--则是测定某种物质的“有”或“无”，用于未知病人的确认诊断。
定量测定报告：反映被检标本中病毒DNA/RNA存在的多少； “copies/ml”表示每毫升血清中病毒基因组的拷贝数，该数据越大，表明病毒在人体内的复制越活跃例如“HBV DNA=4.3×103 copies/ml” 代表每毫升血清中有4300个乙肝病毒 “10n”：n越大，表示含量越高 “＜1.0×103 copies/ml”—有没有HBV感染？------结合其他指标判断,11,乙型肝炎病毒检测,12,13,乙型肝炎病毒结构及特点,HBsAg：是HBV感染的主要标志 HBsAb：保护性抗体 HBcAg：仅存于感染的肝细胞核内，一般不存在于血循环中 HBcAb: 非保护性抗体，HBcAb-IgM提示HBV处于复制状态 HBeAg：HBV复制及强感染性的指标 HBeAb：有一定的保护作用，预后良好,14,HBV感染细胞的过程,HBV侵入肝细胞后，部分双链环状HBV DNA在细胞核内以负链DNA为模板延长正链以修补正链中的裂隙区，形成共价闭合环状DNA (cccDNA)；然后以cccDNA为模板，转录成几种不同长度的mRNA，分别作为前基因组RNA和编码HBV的各种抗原； cccDNA半寿 (衰) 期较长，很难从体内彻底清除，病毒DNA可发生整合……,,重组乙肝疫苗(Hepatitis B vaccines, HepB)和HBIG联合应用可有效降低HBsAg阳性母亲所生婴儿及儿童的HBV感染率，对HBV感染高危儿的保护作用可达90%以上。
16,乙型肝炎诊断,临床诊断 既往有乙型肝炎病史或HBsAg阳性超过6个月，现HBsAg和（或）HBV-DNA仍为阳性者，可诊断为慢性HBV感染可分为： 慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化、携带者、隐匿性慢性乙型肝炎 实验室诊断☼ 生物化学检查：ALT、AST、血清白蛋白、PT、胆碱酯酶、AFP☼ 血清学检查：乙肝蛋白标志物☼ HBV-DNA、基因型和变异检测：定量检测、分型和耐药突变检测 影像学诊断 病理学诊断,17,HBV DNA检测的临床意义,HBV存在最直接的依据，HBV复制和患者具有传染性的标志； 调查表明并不是所有“大三阳”的病人都处于HBV复制期，具有传染性；也不是所有“小三阳”的病人HBV都无复制因此，要准确知道HBV是否处于复制状态，最准确的方法还是通过检测HBV DNA来决定只要抽血化验检测乙肝病毒DNA 呈阳性，无论其他乙肝病毒检测结果如何，都说明患者体内存在复制状态的乙肝病毒，血液具有一定传染性 弥补HBV变异造成的免疫学方法Ag / Ab的漏检 HBeAg(-)[/抗Hbe(+)]：前C区变异 HBsAg(-)：S区变异 低水平感染：单项抗HBc(+) 可检测出隐匿性慢性乙型肝炎 目前判断乙肝抗病毒药物疗效最敏感的指标。
18,HBV DNA结果应用的说明,HBV DNA 定量不能说明病情轻重，乙肝病毒DNA 定量数值只能说明游离在血液中病毒的含量，病毒多少、含量高低与病情严重程度没有直接关系； HBV DNA水平随时都在发生变化：两周左右复查 乙肝病毒本身不引起肝细胞病变，感染的肝细胞仍然是长寿的，半衰期6 ～12个月或更长；乙肝病情轻重决于很多因素，例如患者的免疫状态、遗传因素、病毒的变异等，病毒数量多少不是病情演变的决定因素19,HBV蛋白标志物检测的影响因素,样本采集与处理的影响 标本严溶血或混有红细胞易造成假阳性； 塑料试管能吸附抗原物质造成假阴性； 抗凝剂影响：肝素抗凝血易造成假阳性，EDTA、NaN3可抑制HRP(辣根过氧化物酶)活性造成假阴性； 标本凝固不全，有纤维蛋白原残留，易造成假阳性20,HBV蛋白标志物检测的影响因素,试剂及方法的影响 不同厂家试剂质量差异参差不齐：灵敏度、特异性、孔间吸光度差、标记酶的活性及显色液的稳定性等存在一定的差别； 不同方法灵敏度不同，对变异及亚型的检出能力不同21,HBV蛋白标志物检测的影响因素,操作技术的影响 加样器的洁净与否和吸量的准确性，直接影响检测结果； 温浴影响：干浴与水浴，边缘效应； ELISA操作的重要环节：冼涤，立式洗板机； 结果判读：必须使用酶标仪检测，每板保留一个空白、至少2个阴性对照，1个阳性对照。
22,HBV蛋白标志物检测的影响因素,HooK效应的影响：应用ELISA一步法时，一些标本中抗原含量过高，产生HooK效应，影响检测结果，所以现在强制要求采用两步法，或使用线性范围宽的定量法，以减HooK反应的发生 干扰物质的影响：有人统计发现大约40%的人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果；常见的干扰物质有：RF、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠Ig 抗体、交叉反应物质、高浓度的AFP（如孕妇）等23,HBV蛋白标志物检测的影响因素,药物的影响：高效价的乙肝免疫球蛋白会与sAg形成复合物，影响sAg的检出，所以sAg阳性患者注射乙肝免疫球蛋白后，sAg检测会呈阴性反应； 乙肝大三阳的孕妇，为阻断乙肝母婴垂直传播时，在孕第8、9、10月常规注射乙肝免疫球蛋白，不仅影响孕妇HBsAg的检出，而且乙肝免疫球蛋白属IgG抗体能通过胎盘进入胎儿体内与胎儿血液中的HBsAg结合形成复合物，影响新生儿HBsAg的检出，导致“sAg-eAg+cAb+”（35阳性）等少见模式的出现24,HBV DNA检测不受上述因素影响,,25,HBV-DNA检测原始数据分析,26,由于HBV-DNA聚合酶缺乏校正机制，在拉米夫定外在选择压力下，易发生YMDD(YIDD和YVDD)变异，耐药一旦发生，抗病毒疗效即显著降低，而某些核苷类似物（阿德福韦、恩替卡韦）等对YMDD变异株有抑制作用，临床治疗有效，因此使用拉米夫定的HBV患者进行YMDD变异检测十分重要，有助于监测肝炎病情、评价抗病毒疗效，及时调整治疗方案。
YMDD：酪氨酸－蛋氨酸－天门冬氨酸－天门冬氨酸 YMDD位于HBV多聚酶的关键功能区，如发生YMDD变异，则其中的蛋氨酸(M)突变为异亮氨酸(isoleucine，I)或缬氨酸(valine，V)形成YIDD变异株或YVDD变异株 YMDD变异检测,27,若定量结果为阴性，则判定该样本为 HBV 阴性为什么HBsAg阴性不能排除HBV感染？,窗口期 蛋白检测试剂不够灵敏：需检测HBV-DNA 隐匿性慢性乙肝（S基因变异） 重叠HCV感染（干扰HBsAg合成）,29,HBsAg血清学转换不要轻易判断为治愈,错误认识：HBsAg转换为抗-HBs意味着HBV清除或乙肝治愈 抗HBs阳性就万无一失了吗！？ No. 血清HBsAg转阴并非代表HBV清除或乙肝治愈； 单一抗HBs阳性HBV DNA检出率0-11.8%；单项抗-HBs阳性者经肝穿刺活检，89.2%为慢性乙肝(58/65)，仍存在HBV-DNA复制，并有导制肝纤维化或肝硬化可能30,丙型肝炎病毒检测,31,丙肝病毒,单股正链RNA病毒(9.6kb) RNA 聚合酶缺乏校正功能 易变异 6个基因型和不同亚型：如1a 2b 3c 1a呈全球分布 占70% 我国以Ⅱ型为主，在中国的平均感染率为3.2% 每30人中有一人感染丙肝病毒,32,HCV电镜照片,中国慢性丙型肝炎的分布,33,丙肝传播途径及变化,34,传统传播方式（输血、吸毒）：60% 新型传播方式：30-40% 文身、文眉、美容、美甲、在非正规医院拔牙、洗牙、修脚、不洁性行为、静脉药瘾等,HCV：比乙肝难防、难治！,首先从症状上说，乙肝容易活动，表现出的症状比较多，如黄疸、转氨酶升高等，相对更容易被发现；而丙肝症状很不明显，最常见的表现是疲劳，容易与工作引起的疲劳混淆； 其次虽然两者途径一样，但传播后结果不同：成人感染丙肝病毒后有60～80%会发展为慢性丙肝，而成人感染乙肝病毒后只有5～10%的人发展为慢性乙肝； 再次从预防上，乙肝可以通过接种疫苗进行预防，而丙肝目前还没有预防性疫苗；最后也是最重要的一个区别就是，丙型肝炎通过积极的规范治疗是有很大可能被治愈的。
35,丙肝自然史,36,,,,,,,,,,乙肝病人肝硬化后肝癌的概率10%，而丙肝则是30% 合并HBV感染、嗜酒(≥50g/d)、NAFLD等，促进疾病发展,未清除者约有60～80％出现慢性化,90％患者抗HCV阳性 仍有10%无抗体产生,外周血检出HCV RNA 出现临床症状时，仅有50％～70％患者抗-HCV阳性,肝硬化和HCC是慢性丙型肝炎患者的主要死因； 乙肝病人中导致肝硬化后再转变为肝癌的概率是10%，而丙肝则是30%HCV蛋白标志物的应用缺陷,HCV抗原很难检测，抗HCV-IgM在病毒感染后即可检测到，一般持续1～3个月，抗HCV-IgG可长期甚至终生携带； 慢性丙型肝炎长期抗HCV阳性，只表示曾经感染了丙肝病毒并出现了相应的免疫应答，并不代表体内仍有丙肝病毒的存在或复制； 抗-HCV抗体检测只能作为高危人群、HCV感染者初筛，不作诊断依据； HCV抗体不是保护性抗体37,HCV-RNA检测的临床应用,HCV-RNA是病毒感染和复制的直接标志，定量测定有助于了解病毒复制程度、抗病毒治疗的选择及疗效评估等； 临床诊断：在免疫学检测的“窗口期”或一部分不产生抗体的丙肝病毒携带者，都可出现HCV-RNA阳性、抗HCV阴性的检测结果；医疗纠纷中的“举证倒置”，患者入院前后进行HCV-RNA的检测； 弥补ELISA方法的高漏检率，HCV-RNA可作为HCV感染诊断的灵敏指标，HCV主要通过输血和血制品传播，对献血员及血制品进行HCV-RNA检测，可以有效减少医源性丙型肝炎的发生和传播。