第十三章 程序性细胞死亡 和细胞衰老,●细胞凋亡(Apoptosis)●细胞衰老(cellular aging或cell senescence),,第一节 细胞凋亡(Apoptosis),●细胞凋亡的概念及其生物学意义●细胞凋亡的形态学和生物化学特征●细胞凋亡的分子调控机理,,细胞程序性死亡,细胞程序性死亡（PCD）是一种基因指导的细胞自我消亡方式 PCD和细胞凋亡的区别在以下方面： PCD是功能性概念，凋亡是形态学概念 PCD的最终结果是凋亡，但凋亡并非都是程序化的 PCD存在于胚胎发育过程中一、动物细胞的程序性死亡,凋亡（apoptosis） 坏死（necrosis） 自噬（autophagy）,（一）细胞凋亡,概念：细胞凋亡是一个主动的由基因决定的自动结束生命的过程，凋亡细胞将被吞噬细胞吞噬蝌蚪尾的消失；脊椎动物的神经系统的发育；发育过程中手和足的形成过程等细胞凋亡特点,①细胞通过出芽的方式形成许多凋亡小体； ②凋亡小体内有结构完整的细胞器； ③不引起炎症； ④线粒体无明显形态变化，溶酶体活性不增加； ⑤内切酶活化，DNA有控降解，凝胶电泳图呈梯状； ⑥凋亡通常是生理性变化，坏死是病理性变化。
www.roche-applied- 1. 生长发育：组织与器官的塑造（趾的分化）；动物变态；皮肤角质形成； 2. 免疫细胞分化：克隆选择； 3. 防御：清除衰老细胞、DNA损伤的细胞、和被病原体感染的细胞二）病理学意义,1. 病原体侵染； 诱导凋亡——HIV 抑制凋亡——Poxvirus 2. 细胞凋亡不足 肿瘤，自身免疫疾病； 3. 细胞凋亡过度 神经退行性疾病（AD，帕金森症）、心肌梗塞、 再生障碍性贫血、骨组织坏死细胞凋亡的形态学特征,◆凋亡的起始：细胞表面的特化结构如微绒毛消失，细胞间接触的消失，但细胞膜依然完整；线粒体大体完整，但核糖体逐渐从内质网上脱离，内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合；染色质固缩，形成新月形帽状结构等形态，沿着核膜分布◆凋亡小体的形成：核染色质断裂为大小不等的片段，与某 些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞质膜所包围细胞表面产生了许多泡状或芽状突起，逐渐形成单个的凋亡小体◆凋亡小体逐渐为邻近的细胞吞噬并消化,,细胞凋亡的生化特征,◆细胞凋亡的主要特征是形成大小为180～200bp特征性的DNA ladders◆凋亡细胞组织转谷氨酰胺酶tTG（tissue Transglutaminase）积累并达到较高水平,,细胞凋亡的检测,1. 形态学，电镜，光镜； 2. DNA凝胶电泳——ladder； 3. 流式细胞计； 4. 核酸内切酶活力检测； 5. 免疫学方法； 6. Annexin V检测细胞膜外表面PS； 7. TUNEL技术。
8. 常用检测细胞凋亡的染料： 二乙酸荧光素（FDA），绿色荧光，活细胞染色 Hoechst 33342或33258，DAPI，吖啶橙（AO），半通透，凋亡和固定后的细胞荧光较强 溴化乙啶（EB）、碘化丙啶（PI）、放线菌素D（7-AAD），不通透，正常和凋亡细胞拒染 可用不同性质的染料对凋亡细胞进行双染色Human embryo at day 4 morula containing 23 nuclei labelled with DAPI (blue), including seven TUNEL-labelled condensed nuclei (pink, arrow) that were excluded from development (Kate Hardy 1999).,诱导细胞凋亡的因子,◆物理性因子，包括射线（紫外线， 射线等），较温和的温度刺激（如热激，冷激）等◆化学及生物因子：包括活性氧基团和分子，DNA和蛋白质合成的抑制剂，激素，细胞生长因子，肿瘤坏死因子（TNF），抗Fas/Apo-1/CD95抗体等,,（二）细胞坏死,细胞受到环境因素伤害，引起细胞死亡的现象。
形态变化的原因：酶性消化、蛋白变性细胞坏死初期，胞质内线粒体和内质网肿胀、崩解，结构脂滴游离、空泡化，蛋白质颗粒增多，核发生固缩或断裂 随坏死进程，细胞质呈强嗜酸性，苏木精/伊红染色呈均一红色 细胞膜不完整，台盼蓝染色阳性(活细胞不着色) DNA随机降解，细胞内容物流出，引起炎症三）细胞自噬,如消化酶来源于死亡细胞本身的溶酶体，则称为自溶（autolysis）；若来源于浸润坏死组织内白细胞溶酶体，则为异溶（heterolysis）细胞凋亡的分子调控机理,●线虫(C.elegans)凋亡研究发现ced3,ced4基因促进细胞凋亡，ced9基因阻止ced3/ced4的激活，抑制细胞凋亡Ced3哺乳类同源物是ICE(Interleukin-1-converting enzyme)，即Caspase1●Caspase家族与凋亡●Bcl-2家族、线粒体与细胞凋亡,,C. elegans是研究细胞凋亡的理想材料（生命周期短，细胞数量少）C. elegans雄虫有1031个体细胞、约1000个生殖细胞 神经系统由302个细胞组成，来自于407个前体细胞，105个细胞发生了PCD 控制线虫PCD的基因有：Ced-3、Ced-4和Ced-9。
Ced-3和 Ced-4诱发凋亡； Ced-9抑制Ced-3、Ced-4的作用2002年10月7日英国人Sydney 、美国人Horvitz和英国人Sulston ，因在PCD方面的研究获诺贝尔诺贝尔生理与医学奖H. Robert Horvitz,John E. Sulston,Sydney Brenner,Caspase家族与凋亡,◆Caspase家族 ·Caspase活性位点是半胱氨酸(Cysteine)， 裂解靶蛋白位点是天冬氨酸残基后的肽 键，因此称为Cysteine aspartic acic specificprotease，即Caspase ◆Caspase活化 ◆胞外信号分子诱导的细胞凋亡途径,,Caspase活化,Caspase自身以非活化的Procaspase存在，其激活依赖于其他的Caspase在它的天冬氨酸位点裂解活化或自身活化,,胞外信号分子诱导的细胞凋亡途径,·凋亡信号通路当细胞接受凋亡信号分子(Fas,TNF等)后，凋亡细胞表面信号分子受体 相互聚集并与细胞内的衔接蛋白(Adaptor protein)结合，这些衔接蛋白又 募集Procaspases聚集在受体部位，Procaspase相互活化并产生级联反应，使 细胞凋亡 ·下游Caspases活化后，作用底物：裂解核纤层蛋白，导致细胞核形成凋亡小体；裂解DNase结合蛋白，使DNase释放，降解DNA形成DNA Ladder;裂解参与细胞连接或附着的骨架和其他蛋白，使凋亡细胞皱缩、脱落，便于细胞吞噬；导致膜脂PS重排，便于吞噬细胞识别并吞噬。
Bcl-2家族、线粒体与细胞凋亡,◆Bcl-2是一种原癌基因，是ced-9在哺乳类中的同源物，能抑制细胞凋亡；与线粒体及内质网膜相结合；Bcl-2蛋白的羧基末端有一穿膜的结构域；Bcl-2家族成员的基因中，常常含有三个保守的Bcl-2同源区，即BH1，BH2和BH3◆Bcl-2、线粒体与细胞凋亡◆哺乳动物细胞中发现的Apaf2即是CytC,,Bcl-2、线粒体与细胞凋亡,◆当Caspase8活化后，它一方面作用于Procaspase3，另一方面使Bid裂解成2个片段，其中含BH3结构域的C-端片段被运送到线粒体，与Bcl-2/Bax的BH3结构域形成复合物，导致细胞色素C释放CytC与胞质中Ced4同源物Apaf-1(凋亡蛋白酶活化因子apoptosis protease activating factor)结合并活化Apaf-1，活化的Apaf-1再活化Procaspase9，最后引起细胞凋亡,,,,,,,,,a 正常T细胞杂交瘤细胞 b 凋亡细胞(扫描电镜) c 凋亡细胞(透射电镜),,caspase 超家族成员及其相应底物,,,,BCL-2家族成员,第二节 细胞衰老 (cellular aging或cell senescence),●Hayflick界限(Hayflick Limitation）●细胞在体内条件下的衰老●衰老细胞结构的变化●细胞衰老的分子机理,,一、Hayflick界限(Hayflick Limitation）,●概念：关于细胞增殖能力和寿命是有限的观点。
细胞，至少是培养的二倍体细胞，不是不死的，而是有一定的寿命；它们的增殖能力不是无限的，而是有一定的界限，这就是 Hayflick界限◆癌细胞或培养的细胞系是不正常细胞，其染色体数目或形态已经不同于原先的细胞◆细胞的增殖能力与供体年龄有关◆物种寿命与培养细胞寿命之间存在着一定的关系●二倍体细胞的衰老是由细胞本身决定的◆决定细胞衰老的因素在细胞内部，而不是外部的环境◆是细胞核而不是细胞质决定了细胞衰老,,,不同年龄来源的人成纤维细胞的增殖代数,二、细胞在体内条件下的衰老,●在机体内，细胞的衰老和死亡是常见的现象，甚至在个体发育的早期也会发生; ●正常情况下终生保持分裂的细胞，其分裂能力是否随着有机体年龄的增高而下降？它们 会不会衰老？◆衰老动物体内，细胞分裂速度显著减慢，其原因主要是G1期明显延长;◆衰老个体内的环境因素影响了细胞的增殖和衰老;◆骨髓干细胞移植实验说明随着年龄的增加，干细胞增殖速度也趋缓慢.,,三、衰老细胞结构的变化,●细胞核的变化●内质网的变化: 衰老动物内质网成分弥散性地分散于核周胞质中，粗面内质网的总量似乎是减少了●线粒体的变化: 通常，细胞中线粒体的数量随龄减少，而其体积则随龄增大●致密体的生成●膜系统的变化,,细胞核的变化,◆体外培养的二倍体细胞，细胞核随着细胞分裂次数的增加不断增大◆细胞核的核膜内折（invagination）、染色质固缩化,,膜系统的变化,◆衰老的细胞，其膜流动性降低、韧性减小◆衰老细胞间间隙连接;细胞膜内（P面）颗粒的分布也发生变化,,四、细胞衰老的分子机理,●氧化性损伤学说：代谢过程中产生的活性氧基团或分子（ROS--- O2-， OH- ， H2O2 ），引发的氧化性损伤的积累，最终导致衰老。
●端粒与衰老：发现端粒长度确实与衰老有着密切的关系，提出细胞衰老的“有丝分裂钟”学说（Harley,1990） ● rDNA与衰老: 酵母染色体外rDNA 环（ERC）的积累，导致细胞衰老 ● 沉默信息调节蛋白复合物（Sir complex）与衰老：Sir complex 存在于异染色质区，其作用在于阻断所在位点DNA转录 ● SGS1基因和WRN基因与衰老： SGS1基因和WRN基因同源,编码解旋酶;酵母sgs1突变体寿命明显短于野生型（平均9.5代:24.5代）; wrn突变引发早老症. ● 发育程序与衰老: ● 线粒体DNA与衰老: Sen-DNA(80年代);mtDNA突变积累与细胞衰老有关.,,,,坏死细胞,凋亡细胞,,,,细胞色素c诱导的凋亡细胞DNA电泳图1．细胞色素c诱导0 h 2．细胞色素c诱导1 h 3．细胞色素c诱导2 h 4．细胞色素c诱导3 h 5．细胞色素c诱导4 h 6．阴性对照 7．Marker（ 自赵允、翟中和）,。