菌种保藏技术根据菌种的生理生化特点,创造一个有利于其休眠或代谢活动处于最低的环境条件,即低温、干燥、缺乏氧气和养料,以及添加保护剂等,使微生物的代谢活动处于最低的状态,但又不至于死亡,从而达到保藏的目的依据不同的菌种或不同的需求,应该选用不同的保藏方法一般情况下,斜面保藏、半固体穿刺、液体石蜡保藏法和砂土管保藏法较为常用,也比较容易制作一）常规保藏方法1、斜面保藏法• 操作步骤：标记试管→接种→培养→保藏将菌种转接在适宜固体斜面培养基上,待其充分生长后, 置4℃ 冰箱中保藏保藏时间依微生物的种类而定霉菌、放线菌及芽孢菌保存2~4个月移种1次,酵母菌间隔两个月,普通细菌1个月,假单胞菌两周传代1次2、半固体穿刺保藏法• 按穿刺接种方式培养菌种,菌种长好后用胶塞封严,置4℃ 的冰箱存放• 操作步骤：标记试管→穿刺接种→培养→保藏• ①贴标签取无菌的半固体肉汤蛋白胨直立柱数支,贴上标签,注明细菌菌名、培养基名称和接种日期• ②穿刺接种用接种针以无菌方式从待保藏的细菌斜面上挑取菌种,朝直立柱中央直刺至试管底部,然后又沿原线拉出• ③培养置37℃ 恒温箱中培养48h• ④保藏半固体直立柱长好以后,放入4℃ 的冰箱中保藏。
这种方法一般可保藏半年至一年3、液体石蜡保藏法• 将无菌石蜡加在已长好菌的斜面上,其用量以高出斜面顶端1cm为准,使菌种与空气隔绝将试管直立,置低温或室温下保存• 霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏2年以上不死,酵母菌可保藏1~2年,一般无芽孢细菌也可保藏1年左右甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎球菌,在37℃温箱内,也可保藏3个月之久• 优点：制作简单,不需特殊设备,且不需经常移种,还可防止干燥• 缺点：保存时必须直立放置,所占位置较大,同时也不便携带• 从液体石蜡下面取培养物移种后,接种环在火焰上烧灼时,培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅,应特别注意4、砂土管保藏此法多用于产芽孢的细菌、产生孢子的霉菌和放线菌在抗生素工业生产中应用广泛、效果较好,可保存几年时间,但对营养细胞效果不佳操作步骤：河砂处理与土壤处理→砂土混合→灭菌→无菌检查→制各菌悬液→加样→干燥→保藏5、滤纸保藏法细菌、酵母菌、丝状真菌均可用此法保藏前两者可保藏2年左右,有些丝状真菌甚至可保藏14~17年之久此法较液氮、冷冻干燥法简便,不需要特殊设备将滤纸剪成0.5cm× 1.2cm的小条,装入0.6cm× 8cm的安瓿管中,每管1~2张,塞以棉塞,121℃ 灭菌30min。
将需要保存的菌种,在适宜的斜面培养基上培养,充分生长取灭菌脱脂牛乳(脱脂牛乳的处理：牛乳2000r/min离心10min脱脂,然后115℃ 灭菌20min,或间歇灭菌3次,经检查无菌后备用)1~2mL滴加在灭菌培养皿或试管内,取数环菌苔在牛乳内混匀,制成浓悬液用灭菌镊子自安瓿管取滤纸条浸入菌悬液内,使其吸饱,再放回至安瓿管中,塞上棉塞将安瓿管放入内有P2O5作吸水剂的干燥器中,用真空泵抽气至干将棉花塞入管内,用火熔封,保存于低温下需要使用菌种,复活培养时,可将安瓿管口在火焰上烧热,滴一滴冷水在烧热的部位,使玻璃破裂,再用镊子敲掉口端的玻璃,待安瓿管开启后,取出滤纸,放入液体培养基内,置温箱中培养二）真空冷冻干燥保藏方法利用有利于菌种保藏的一切因素,先将微生物在极低温度(-70℃ 左右)下快速冷冻,然后减压下利用升华现象除去水分(真空干燥),使微生物始终处于低温、干燥、缺氧的条件下,因而它是迄今为止最有效的菌种保藏法之一适用于菌种长期保存,一般可保存数年至十余年但设备和操作都比较复杂操作流程：准备安瓿管→准备脱脂乳→准备菌种→制备菌悬液→分装样品→冷冻→真空干燥→封管→存活性检测→保藏→活化。
安瓿管先用2%HCl浸泡,再水洗多次,烘干将标签放入安瓿管内,管口塞上棉花,121℃ 灭菌30min,备用一般,细菌要求24~48h的培养物;酵母需培养3d;形成孢子的微生物则宜保存;放线菌与丝状真菌则培养7~10d。