紫外吸收法测定核酸的含量一、 目的学习紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法，熟悉紫外分光光度计的根本原理和使用方法二、 原理核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统〔－C＝C一C＝C一〕，能够强烈吸收250~280nm波长的紫外光核酸〔DNA，RNA〕的最大紫外吸收值在260nm处遵照Lambert-Beer定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量在不同pH溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之表现出明显的差异，它们的摩尔消光系数也随之不同所以，在测定核酸物质时均应在固定的pH溶液中进行核酸的摩尔消光系数〔或吸收系数〕，通常以ε〔ρ〕来表示，即每升含有一摩尔核酸磷的溶液在260nm波长处的消光值〔即光密度，或称为光吸收〕核酸的摩尔消光系数不是一个常数，而是依赖于材料的前处理、溶液的pH和离子强度发生变化它们的经典数值〔pH = 7.0〕如下：DNA的ε〔ρ〕= 6 000 ~ 8 000RNA的ε〔ρ〕= 7 000 ~ 10 000 小牛胸腺DNA钠盐溶液〔pH = 7.0〕的ε〔ρ〕= 6 600，DNA的含磷量为9.2%，含1μg/mL DNA钠盐的溶液光密度为0.020。
RNA溶液〔pH = 7.0〕的ε〔ρ〕= 7 700~7 800，RNA的含磷量为9.5%，含1μg /mL RNA溶液的光密度为0.022~0.024采用紫外分光光度法测定核酸含量时，通常规定：在260nm波长下，浓度为1μg/mL的 DNA溶液其光密度为0.020，而浓度为1μg/mL的RNA溶液其光密度为0.024因此，测定未知浓度的DNA〔RNA〕溶液的光密度OD260nm，即可计算测出其中核酸的含量该法简单、快速、灵敏度高，如核酸3μg／mL的含量即可测出对于含有微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质的核酸样品，测定误差较小，假设样品内混杂有大量的上述吸收紫外光物质，测定误差较大，应设法事先除去由于降解或水解作用，核酸的光密度可以增高约40％，这就是众所周知的增色效应〔hyperchromic effect〕在大分子的核酸中，氢键和π-键相互作用改变了碱基的共振行为因此，核酸的光密度低于构成它的核苷酸的光密度，该现象称为减色效应〔hypochromic effect〕三、实验材料、主要仪器和试剂1．试材：核酸样品DNA或RNA2． 主要仪器〔1〕分析天平 〔2〕紫外分光光度计〔3〕冰浴或冰箱〔4〕离心机〔5〕离心管〔10mL〕〔6〕烧杯〔10mL〕〔7〕容量瓶〔50mL、100mL〕〔8〕移液管〔0.5ml、2mL和5mL〕〔9〕药品勺和玻璃棒〔10〕试管和试管架。
3．试剂〔1〕5%~6%氨水：用25%~30％氨水稀释5倍〔2〕钼酸铵-过氯酸试剂：取3.6mL70%过氯酸和0.25g钼酸铵溶于96.4mL蒸馏水中四、操作步骤1．核酸样品纯度的测定〔1〕准确称取待测的核酸样品0.5g，加少量蒸馏水〔或无离子水〕调成糊状，再加适量的水，用5%~6%氨水调至pH7，定容至50mL〔2〕取两支离心管，甲管内参加2mL样品溶液和2mL蒸馏水；乙管内参加2mL样品溶液和2mL沉淀剂〔沉淀除去大分子核酸，作为对照〕混匀，在冰浴〔或冰箱〕中放置30min，3 000r/min离心10min从甲、乙两管中分别取0.5mL上清液，用蒸馏水定容至50mL选用光程为1cm的石英比色杯，在260nm波长下测其光密度〔3〕计算 如果待测的核酸样品不含酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，那么可将样品配制成一定浓度的溶液〔20~50μg/mL〕在紫外分光光度计上直接测定2．核酸溶液含量的测定当待测的核酸样品中含有酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，在测定时需要加钼酸铵-过氯酸沉淀剂，沉淀除去大分子核酸，测定上清液260 nm处光密度作为对照〔1〕取2支离心管，每管各参加2mL待测的核酸溶液，再向甲管内加2mL蒸馏水，向乙管内加2mL沉淀剂。
混匀，在冰浴〔或冰箱〕中放置10min，3 000r/min离心10min将甲、乙两管清液分别稀释至光密度在0.1~1.0之间选用光程为1cm的石英比色杯，在260nm波长下测其光密度OD260nm〔2〕计算五、思考题1．采用紫外光吸收法测定样品的核酸含量，有何优点及缺点？2．假设样品中含有核苷酸类杂质，应如何校正？参考答案1．用紫外光吸收法测定样品的核酸含量，具有简单、快速、灵敏度高的优点，并且待测核酸样品中含有的微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质，产生较小测定误差但该法在测定样品内混杂有大量的上述吸收紫外光物质时，那么会产生较大测定误差，需要设法事先除去2．当样品中含有核苷酸类杂质时，需要加钼酸铵-过氯酸沉淀剂处理，沉淀除去大分子核酸，测定上清液260 nm处光密度，以此作为对照；再从未加沉淀剂测得的样品液260nm光密度中扣除六、附 注：化学法测定DNA的含量——二苯胺显色法〔一〕原理DNA在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键断裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸，而2-脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊糖，与二苯胺试剂反响生成蓝色物质，在595nm波长处有最大吸收。
DNA在40~400μg范围内，光吸收与DNA的浓度成正比在反响液中参加少量乙醛，可以提高反响灵敏度〔二〕试剂及器材1． DNA标准溶液准确称取小牛胸腺的DNA钠盐，以0.01mol／L NaOH溶液配成200μg／mL的溶液2． 测定样品溶液准确称取枯燥的DNA制品，以0.01mol／L NaOH溶液配成100~150μg／mL的溶液假设要测定RNA制品中的DNA含量，样品中至少要含有DNA 20μg／mL 才能进行测定3． 二苯胺试剂称取1g二苯胺， 溶于100mL的分析纯的冰乙酸中，再参加60％以上的过氯酸10mL，混匀待用临用前参加1mL的1.6％乙醛，配好的试剂应为无色4．分光光度计〔三〕操作方法1． 制作DNA标准曲线：取12支洁净枯燥试管按表1参加试剂：表1 DNA标准曲线制作管号DNA标准溶液〔mL〕H2O〔mL〕二苯胺试剂〔mL〕DNA含量〔μg〕1，202.0403，40.41.64805，60.81.241607，81.20.842409，101.60.4432011，122.004400按上表加完各试剂后，充分混匀于60℃水浴中保温1h，冷却后于595nm波长处以1，2管为空白调零，测定各管光密度〔OD595nm〕。
取两管的平均值，以DNA的含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线2． 样品DNA含量测定：取2支干净试管按表2参加试剂，其它操作同上表2 样品DNA含量测定管号DNA待测溶液*〔mL〕二苯胺试剂〔mL〕OD595nmDNA含量〔μg〕1’24 2’24 *待测溶液中的DNA含量应调整至标准曲线的可读范围内3． DNA含量计算：以样品的光密度，从标准曲线上查出相对应DNA含量，按下式计算出样品中DNA的百分含量DNA〔%〕=待测液中测得的DNA量〔μg〕×100待测液中样品的量〔μg〕附 注：二苯胺试剂具有腐蚀性，且二苯胺反响产生的蓝色不易褪色，操作中应防止洒出，比色时，比色杯外面一定要擦干净 〔吕淑霞〕 实验指导>>沈阳农业大学生化实验指导>>核 酸 根底生物化学教育网三疣梭子蟹别名很多，又称梭子蟹、枪蟹、海螃蟹、海蟹、海虫、水蟹、门蟹、童蟹、飞蟹雄蟹反面茶绿色，雌蟹紫色头胸甲呈梭形，稍隆起外表有3个显著的疣状隆起，两前侧缘各具9个锯齿，第9锯齿特别长而大，向左右伸延。
额部两侧有1对能转动的带柄复眼额缘有4枚小齿有胸足5对螯足兴旺第4对步足指节扁平宽薄如桨，适于游泳腹部扁平(俗称蟹脐)，雄蟹腹部呈三角形，雌蟹呈圆形腹面均为灰白色。