第五章第五章 重组蛋白质的重组蛋白质的 表达、复性与纯化表达、复性与纯化为什么要重组基因表达？为什么要重组基因表达？1.1. 蛋白质功能研究蛋白质功能研究2.2. 生物制药和疫苗生产生物制药和疫苗生产3. 3. 疾病的基因治疗疾病的基因治疗4.4. 食品、化工用酶制剂食品、化工用酶制剂5.5. 抗虫、抗逆植物改良抗虫、抗逆植物改良 6. 6. 细胞代谢产物的富集细胞代谢产物的富集• •基因表达体系及优劣势基因表达体系及优劣势 • •大肠杆菌表达体系大肠杆菌表达体系 • •蛋白质的复性蛋白质的复性 • •工作中经常碰到的问题工作中经常碰到的问题基因表达体系基因表达体系1.1. 原核体系原核体系 2.2. 真核体系真核体系大肠杆菌大肠杆菌 ( (Escherichia coliEscherichia coli) )•遗传背景清楚，基因工程 操作方便，商品化表达载体种 类齐全，表达效率高； •基本不分泌，易形成包含 体(无正确折叠的立体结构)， 无加糖等修饰枯草杆菌枯草杆菌 ( (Bacillus Bacillus subtilissubtilis) )•分泌蛋白质能力强，一般有天然立体结构；•无加糖修饰功能，培养液中蛋白酶活性高，重组蛋白易受蛋白酶的水解；•质粒不稳定，已有商品化的表达载体（枯草芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌）。
其其 他他 •乳酸菌 (Lactic acid bacteria) •沙门氏菌 (Salmonella typhimurium) •苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)真核细胞表达体系真核细胞表达体系 酵母细胞酵母细胞 昆虫细胞昆虫细胞 植物细胞植物细胞/ /组织组织 哺乳动物细胞哺乳动物细胞/ /组织组织酵母细胞酵母细胞•可生产分泌型蛋白；有天然立体结构 ，有糖基化修饰功能；可进行染色体整合 型基因表达;•糖链与哺乳动物加工的不一致，培养 上清多糖浓度高;•商品化表达体系：酿酒酵母（Saccharomyce cerevisiae）;毕氏酵母 (Pichia pastoris);裂殖酵母（Schizosaccharomyce pombe）1.O-糖基化: 糖链通过GalNAc连接在蛋白质的Ser或Thr等侧链的羟基处2.N-糖基化: 糖链连接在Asn-X-Ser或Asn-X-Thr（X是除Pro以外的任何氨基酸）中Asn的氨基侧链处3.GPI-Anchor糖基化: 蛋白质通过肽链的C端共价连接的糖基磷脂酸肌醇锚定在膜脂上蛋白质糖基化的分类昆虫细胞昆虫细胞•可以病毒感染的形式在成虫中生 产，也可在体外培养细胞生产蛋白;•适合分泌型和膜蛋白的表达，有 加糖修饰； •糖链有所区别，表达量有限； •作为药物宿主细胞未被FDA认可CHOCHO细胞细胞•可进行分泌表达，有天 然立体结构，加糖方式与人 体蛋白质完全一致； •表达量不够高，培养成 本较高植物组织植物组织 •植物可大面积种植，可以 廉价大规模生产； •转基因植物制作费时，表 达的组织特异性较难控制； •表达量较难提高，分离纯 化不方便动物乳腺组织动物乳腺组织 •分泌生产有天然立体结构 和活性的蛋白质至乳汁，产量 高，分离纯化方便，特别适合 药用蛋白的生产； •转基因动物制作花费巨大 ，实验周期长鸟类输卵管组织鸟类输卵管组织•分泌生产有天然立体结构的蛋白质到蛋清，产量高，容易贮存和运输，分离纯化方便；•实验成本低，饲养费用低；•加糖方式可能与人有所不同体系选择体系选择研究基因功能研究基因功能: : 大肠杆菌大肠杆菌, , 裂殖酵母裂殖酵母, ,昆虫细胞昆虫细胞, , CHOCHO 细胞细胞 多肽药物生产多肽药物生产: : 大肠杆菌大肠杆菌, , 毕氏酵母毕氏酵母, , CHOCHO细胞细胞, , 乳乳 腺组织腺组织 疫苗疫苗: : 大肠杆菌大肠杆菌, , 酵母酵母, , 大多数沿用细胞培养产物进行大多数沿用细胞培养产物进行 灭毒灭毒 单抗生产单抗生产: : 杂交瘤细胞杂交瘤细胞 工业酶生产工业酶生产: : 各种微生物各种微生物 在大肠杆菌中直接生产有活性的胰岛素在大肠杆菌中直接生产有活性的胰岛素 在大肠杆菌中生产人凝血在大肠杆菌中生产人凝血IXIX因子因子 在大肠杆菌生产在大肠杆菌生产CalcitoninCalcitonin类类C C端酰胺化短肽端酰胺化短肽 在大肠杆菌中进行蛋白质的糖基化修饰在大肠杆菌中进行蛋白质的糖基化修饰 在酵母中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化在酵母中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化 在鸡输卵管中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化在鸡输卵管中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化 提高乳腺分泌表达的提高乳腺分泌表达的Factor IXFactor IX类因子的活性类因子的活性 在植物中得到与哺乳动物细胞一致的糖基化在植物中得到与哺乳动物细胞一致的糖基化有可能以后能做到的事有可能以后能做到的事在大肠杆菌中表达在大肠杆菌中表达 重组蛋白质重组蛋白质• •如果目的蛋白质有二硫键并需要如果目的蛋白质有二硫键并需要 正确的立体结构正确的立体结构, , 尽可能进行可尽可能进行可 溶性表达溶性表达; ; • •如果目的蛋白质没有二硫键或只如果目的蛋白质没有二硫键或只 用来制备抗血清用来制备抗血清, , 采用包含体表达采用包含体表达 比较好比较好; ; • •如果目的多肽的分子量小于如果目的多肽的分子量小于 10 10 kDa, kDa, 一定要进行融合表达一定要进行融合表达按蛋白质类型分按蛋白质类型分 • • 单纯表达单纯表达: : pJLApJLA系列系列, , 用用NcoI/NdeINcoI/NdeI导入导入AUGAUG的载体的载体 • • 融合表达融合表达: : 融合各种融合各种tag, GST, CBD, MAL, GFP, etctag, GST, CBD, MAL, GFP, etc • • 分泌表达分泌表达: : pel/ompTpel/ompT分泌肽分泌肽 按启动子分按启动子分 • • laclac及衍生的及衍生的tactac , , trctrc, , pacpac, , racrac等启动子等启动子 IPTGIPTG诱导诱导 • • lamdalamda phage P phage PL L和和P PR R启动子启动子 热诱导热诱导 • • T7 T7 启动子启动子 IPTGIPTG诱导诱导 • • T5 T5 启动子启动子 IPTGIPTG诱导诱导 • • araara启动子启动子 阿拉伯糖诱导阿拉伯糖诱导大肠杆菌表达载体分类大肠杆菌表达载体分类• •pJLA50XpJLA50X系列系列; ; pcDNAIIpcDNAII; etc; etc • •pETpET系列系列 (T7 promoter, (T7 promoter, NovagenNovagen公司公司) ) • •pQEpQE系列系列 (T5 promoter, (T5 promoter, QiagenQiagen公司公司) ) • •pMALpMAL系列系列 ( (周质表达周质表达, , BioLabsBioLabs公司公司) ) • •pGEXpGEX系列系列 (GST(GST融合表达融合表达, Pharmacia, Pharmacia公司公司) ) • •pBADpBAD系列系列 ( (ArabinoseArabinose诱导型诱导型) )常用表达载体常用表达载体• •pTYBpTYB系列系列 (CBD(CBD融合融合, , 可以自我切割可以自我切割, , BioLabsBioLabs) )• • Protein A Protein A • • GSTGST（（glutathione S-glutathione S-transferasetransferase）） • • CBD (chitin-binding domain, CBD (chitin-binding domain, BioLabsBioLabs; ;cellulose-binding domain, cellulose-binding domain, NovagenNovagen) )calmodulincalmodulin-binding domain, -binding domain, StratageneStratagene) ) • • MBP (maltose-binding protein)MBP (maltose-binding protein) • • GFP (green fluorescence protein)GFP (green fluorescence protein) • • ThioredoxinThioredoxin ** **帮助二硫键形成帮助二硫键形成 • • DsbDsb ( (periplasmicperiplasmic enzyme enzyme DsbADsbA, , DsbCDsbC) ) ** ** 二硫键的形成与二硫键的形成与 • • SUMO (small SUMO (small ubiquitinubiquitin-related modifier) -related modifier) • • KSI (KSI (ketosteroidketosteroid isomeraseisomerase) ) 基本上全部沉淀基本上全部沉淀各种融合蛋白表达载体各种融合蛋白表达载体帮助可溶化帮助分泌到周质可用亲和层析纯化• •采用采用MBPMBP融合融合 • •采用采用GSTGST融合融合 • •采用采用CBDCBD融合融合 • •采用采用thioredoxinthioredoxin融合融合 • •采用采用OrigamiOrigami等宿主菌等宿主菌 • •降低菌体培养的速度降低菌体培养的速度温度温度 (15-30(15-30℃℃), ), 降低转速降低转速 让表达产物可溶化让表达产物可溶化• •采用采用CBDCBD融合融合 (pET36/37)(pET36/37) • •采用采用DsbDsb融合融合 (pET39/40)(pET39/40) • •采用带采用带pelB/ompTpelB/ompT引导肽的载体引导肽的载体(pET12/20/22)(pET12/20/22) • •采用带采。