第五章发酵产物的提取与精制内容n1.概述n2.发酵液的预处理n3.固液分离n4.细胞破碎n5.初步纯化n6.精细纯化n7.成品加工1.概述发酵产物的提取与精制是发酵工程不可分 割的重要组成部分:n获得高品质的发酵产品；n提取与精制技术的进步及工艺优化可以 对发酵工程上游提出新的技术及工艺改 进要求整个下游提取精制加工过程应遵循如下原则：n快速操作n低温环境n温和条件n尽可能小的剪切作用和防止污染n对于基因工程产品，还应注意生物安全1.1 提取与精制过程的一般工艺流程图5-1 目的产物提取与精制过程的一般工艺流程n整个分离路线一般可分为以下五个主要 步骤：预处理、固液分离、初步纯化、 精细纯化、成品加工n预处理：采用加热、调整pH、絮凝等措施和单元操作改变 发酵液的理化性质，为固液分离作准备n固液分离：采用珠磨、匀浆、酶溶、过滤、离心等单元操 作除去固相，获得包含目的产物的液相，供进一步分离纯 化用n初步纯化：采用萃取、吸附、沉淀、离心等单元操作，将 目的成分与大部分杂质分离开来n精细纯化：采用层析、电泳、分子蒸馏等单元操作，将目 的成分与杂质进一步分离，使产物达到预期标准n成品加工：采用结晶、浓缩、干燥等单元操作，将目的产 物加工成适应市场需要的商品。
1.2 发酵产物提取精制方法的优 化与工艺设计n目标：产率高、品质优、成本低、操作简便、无环境 污染n实现这一目标的基本原则：采用的分离纯化步骤尽可 能少，应用单元操作的次序和工艺设计要合理n在纯化方法的选择和设计的过程中，应注意充分总结 并参考前人的大量实践结果n在初步选定各个单元操作方法之后，确定各个单元操 作的先后次序一般来说，收率高、纯度稍低的方法 在前，纯度高的方法在后内容n1.概述n2.原料与预处理n3.固液分离n4.细胞破碎n5.初步纯化n6.精细纯化n7.成品加工n发酵液的特性： ①发酵产物浓度低，处理体积大 ②微生物细胞的颗粒小，相对密度与液相相差不大 ③细胞含水量大，可压缩性大，一经压缩就会变形 ④液相黏度大，容易吸附在滤布上 ⑤产物性质不稳定2.1 改变发酵培养物的过滤特性改变发酵培养物过滤特性的方法：n降低发酵培养物的黏度n采用添加絮凝剂n调整发酵液培养物pH2.1.1 降低液体黏度n滤液通过滤饼的速率与液体的黏度成反比，因此降低 液体黏度可以提高过滤效率 （1）加水稀释法：能降低液体黏度，但会增加发酵液的 体积，加大后续过程的处理量采用此法时要慎重考 虑 （2）加热升温法： 可以有效降低液体黏度，提高过滤 效率。
但加热温度和时间必须控制在不影响目的产物 活性的范围内，而且要防止加热导致的细胞溶解，胞 内物质外溢，增加发酵液的复杂性和随后的产物分离 纯化 （3）酶解法 发酵液中如含有多糖类物质，则可用酶将 它们降解成寡糖或单糖，以提高过滤效率2.1.2 凝聚与絮凝u通过有效地改变菌体细胞和蛋白质等胶体粒子的分散状态，使其 凝聚成较大的颗粒，便于过滤 （1）凝聚：在中性盐的作用下，由于胶体粒子之间双电子层排斥电 位的降低，而使胶体体系不稳定出现聚集的现象n发酵液中的菌体细胞或蛋白质等胶体粒子的表面，一般都带有电 荷在生理pH下，发酵液中的菌体或蛋白质常常带有负电荷，由 于静电吸引作用，在界面上形成了双电层，这种双电层的结构使 胶粒间不容易聚集而保持稳定的分散状态n向胶体悬液中加入某种电解质，在电解质中异电离子的作用下， 胶粒的双电层电位降低，使胶体体系不稳定，从而相互碰撞而产 生凝聚n常用的凝聚电解质有硫酸铝，氯化铝、氧化铁等 （2）絮凝：是指在某些高分子絮凝剂存在的情况下，基于架桥作用 ，使胶粒形成絮凝团的过程n絮凝剂是一种水溶性的高分子聚合物，具有长链结构，其链节上 含有相当多的活性官能团，通过静电引力、范德华引力或氢键的 作用，能强烈地吸附在胶粒的表面。
当一个高分子聚合物的许多 链节分别吸附在不同的胶粒表面上产生架桥连接时，就形成了较 大的絮团，从而产生絮凝作用n发酵工业适宜的絮凝剂包括：有机高分子类如聚丙烯酰胺类衍生 物，无机高分子聚合物絮凝剂如聚合铝盐，以及天然有机高分子 絮凝剂如海藻酸类、明胶、几丁质等3）混凝：同时包括凝聚和絮凝作用的过 程n加入电解质，使悬浮离子间的双电层电 位降低，脱稳，凝聚成微粒，然后再加 入非离子型和阴离子型高分子絮凝剂凝 聚成较大的颗粒，以提高絮凝效果2.1.3 调节发酵液pHnpH直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质对 于氨基酸、蛋白质等两性物质，在等电点下，溶解度最 小，因此可利用此特性分离或除去两性物质n调整pH也可以改变某些物质的电荷性质，使之转入液相 ，可以减少膜过滤的堵塞和膜污染 2.1.4加入助滤剂n助滤剂可以作为胶体粒子的载体，均匀地分布 于滤饼层中，相应地改变滤饼结构，降低滤饼 的可压缩性，从而减少过滤阻力n目前发酵工业中常用的助滤剂是硅藻土、珍珠 岩粉、活性炭等，其中最常用的是硅藻土使 用方法有两种：一是在过滤介质表面预涂助滤 剂，另一种是直接加入到发酵液中，也可两种 方法同时使用。
2.2 发酵液的相对纯化n发酵液中杂质很多，对后提取步骤分离影响最大的是杂蛋白和高 价无机离子等n杂蛋白去除方法： ①通过加热、大幅度改变pH，以及加乙醇、丙酮等有机溶剂等方法 使杂蛋白变性 ②通过加入无机盐使杂蛋白沉淀在酸性溶液中，蛋白质能与一些 阴离子如三氯乙酸盐、水杨酸盐、过氯酸盐等形成沉淀在碱性 溶液中，能与一些阳离子如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+等形成沉淀n高价无机离子的去除方法： ①为去除钙离子，宜加入草酸反应生成的草酸钙还能促蛋白质凝 固，提高滤液质量但草酸价格较贵，应注意回收 ②要除去铁离子，可加入黄血盐，与铁离子形成普鲁士蓝沉淀内容n1.概述n2.原料与预处理n3.固液分离n4.细胞破碎n5.初步纯化n6.精细纯化n7.成品加工n发酵液或多或少存在悬浮固体，需要使 用固液分离手段使清液和固态物质得到 很好的分离常用的方法是过滤和离心 分离3.1 过滤分离技术n过滤：在压力（或真空）的情况下将悬浮液通过过滤介质以达到 固液分离的目的 n微生物的发酵液大多属于非牛顿型流体，滤渣是可压缩性的 n滤饼的质量比阻γB：表示单位滤饼厚度的阻力系数，与滤饼的结 构特性有关。
对于不可压缩性滤饼，比阻值为常数但对于可压 缩性滤饼，比阻γB是操作压力差的函数，一般可用下式表示式中，γ-不可压缩滤渣的比阻；p -压力差，Pa；m-压缩性指数，一般取0.5-0.8，对不可压缩性滤饼，m为0γB = γ(△p)m (1)n应用较广的过滤设备有压力过滤、真空 过滤和错流过滤三种①压力过滤n最常见的压力过滤装置是板框过滤机n它的过滤介质为滤布，当悬浮液通过滤布时，固体颗 粒被滤布阻隔而形成滤饼，滤饼达到一定厚度时起过 滤作用，压力来自于液压泵n与其他设备相比，它的优点是：结构简单，过滤面积 大；过滤的推动力（压力差）能大幅度调整，并能耐 受较高的压力差，因而固相含水分低，并能适应不同 过滤特性的发酵液的过滤；辅助设备少、价格低、动 力消耗少n主要缺点是：设备苯重、间歇操作、劳动强度大、辅 助时间多、生产效率低②真空过滤n最常见的真空过滤是真空转鼓过滤机n工作部件是一个饶着水平轴转动的鼓，在转鼓内维持 一定的真空度，施加于转鼓外边的大气压力即为过滤 的推动力图 5-2 真空转鼓过滤机工作原理示意图③错流过滤n切向流过滤又称错流过滤，是一种维持恒压下高速过滤的技术n其操作特点是使悬俘液在过滤介质表面作切向流动，利用流动的剪切作 用将过滤介质表面的固体（滤饼）移走。
当移走固体的速率与固体的沉 积速率相等时，过滤速率就近似恒定n目前切向流过滤的主要缺点是：切向流所产生的剪切作用可使蛋白质产 物失活图5-3 泵循环式切向流过滤3.2离心分离n离心分离：在离心产生的重力场作用下使悬浮颗粒沉降下 来的操作过程 3.2.1 离心力场的基本特性n分离因数（Fr）和沉降速度（vg）是离心力场的基本特性n离心机的分离因数：离心机在运行过程中产生的离心加速 度和重力加速度的比值式中，r-离心机转鼓半径，cm；ω-转鼓的角速度，s-1Fr =rω2/g (2) ω=2πn/60 (3)n分离因数越大，物料所受的离心力也越大，分离 效果就好 n分离因数Fr与离心机的转鼓半径r和转鼓转速n的 平方成正比，因此，提高转鼓转速比增大转鼓半 径对分离因数的影响要大得多n分离因数的极限值取决于转鼓材料的机械强度， 一般超高速离心机的结构特点是小直径、高转速 3.2.2 离心机的选择n需要根据发酵液的特性来选择离心机图 5-4 根据固体颗粒的大小选择离心机内容n1.概述n2.原料与预处理n3.固液分离n4.细胞破碎n5.初步纯化n6.精细纯化n7.成品加工n细胞破碎技术：是指利用外力破坏细胞壁和细胞膜， 使细胞内目标物释放出来的技术。
n选择什么样的破碎技术和设备实现有效的细胞破碎， 首先要从细胞的种类，特别是细胞壁的类型及其坚韧 程度来考虑第二是考虑目标产品的性质，如产物是 否能承受剪切力、对酸碱和温度的耐受力第三是考 虑破碎的规模、破碎方法和所花费的资金等其他因素 n最常用的检测细胞破碎效果的方法是通过显微镜直接 观察，从中计算出细胞破碎率 ①用革兰氏染色剂进行染色n 破壁的酵母呈粉红色，而未破壁的酵母呈蓝紫色，分 别计数，并采用相同的稀释度用血球计数板进行镜检 计数，计算破壁率破壁率的计算公式如下式所示α=式中，α-破壁率，%；C-破壁前的细胞数；C'-破壁后的细胞数；n1-染色后呈紫色的细胞数；n2-染色后呈粉红色的细胞数②用次甲基蓝染色测定细胞存活率（因为活细胞 中的酶可使染料还原） 取未经灭酶的发酵液 0.5 ml，用9 g/L的生理盐水稀释100倍后，用次 甲基蓝染色5 min，用血球计数板计数，计算出 细胞的存活率n酵母破壁率=[1-(染色细胞总数/酵母细胞总数 )]*100%4.1 常用的细胞破碎方法n按照作用方式的不同划分，常用的细胞 破碎方法可以分为两类：机械类包括高 速珠磨破碎法、高压匀浆破碎法、超声 波破碎法等，非机械类包括化学渗透法 ，酶溶破碎法等。
4.1.1高速珠磨法n原理：微生物细胞悬浮液与极细的研磨剂（通常是直径 1时，表示凝胶具有一定的吸附作用，此时 Ve>Vo+Vi例如某些芳香族化合物的洗脱体积远超出 理论计算的最大值，这些化合物的Kd值一般都是大于1 的6.1.4.2 凝胶色谱介质（1）葡聚糖凝胶 n 葡聚糖凝胶是由多聚葡聚糖通过与环氧氯丙烷交联而合成的，是 一类具有网状结构的珠状凝胶颗粒n葡聚糖凝胶交联的程度与凝胶颗粒网状结构孔径大小有直接关系 ，交联度越大，网状结构的孔径越小，分离的分子量就越小n交联的葡聚糖结构中含有大量的羟基，又具有很强的亲水性，能 迅速在水和电解质溶液中溶胀，在色谱过程中非常容易与水溶性 溶质接触在酸性条件下合成的葡聚糖凝胶糖苷键容易被水解， 在碱性环境中比较稳定常用稀碱溶液处理葡聚糖凝胶色谱介质 ，以除去残留在凝胶介质上的变性蛋白和其他杂质nSephadex G系列产品，英文字母G后面的阿拉伯数字，表示凝胶吸 水量乘以10G”后面的阿拉伯数字越大，表示交联度越小， 凝胶孔径越大，分子量分离范围越大，凝胶的溶胀体积越大2）聚丙烯酰胺凝胶 n聚丙烯酰胺凝胶是一种化学合成的凝胶，组成的基本 单位是丙烯酰胺，交联剂是N,N-亚甲基双丙烯酰胺。
n通过控制丙烯酰胺浓度和N,N-亚甲基双丙烯酰胺的比 例，就可以得到不同交联度的聚丙烯酰胺凝胶n聚丙烯酰胺凝胶在酸性条件下不稳定因此，聚丙烯 酰胺凝胶色谱应当尽量避免使用酸性较强的缓冲液n最常用的聚丙烯酰胺凝胶色谱介质是Bio-Gel-P系列产 品，在Bio-Gel-P系列产品中，“P”后面的阿拉伯数字 越大，表示交联度。