Chapter 3 DNA复制（Replication ）3.1 DNA复制的起点和方向3.1.1 DNA复制的方向p通过实验判断DNA复制的方向实验证实E. coli DNA双向复制E. coli低剂量的3T-dTTP的培养基 数分钟高剂量的3T-dTTP的培养基 数分钟提取E.coli DNAE.coli DNA 放射自显影对不同复制模式的预期结果实际观测结果E.coli DNA 的复制是双向的3.1.2 复制起点和方向的模式复制起点的分离3.1.4 复制起点的结构特征E.coli 的复制起点Ori C与其它细菌的复制起点的序列比较 p以E.coli 的复制起点Ori C为例n是染色体上位置固定的一段DNAn富含ATn含甲基化位点：GATCn重复序列n13bp DR(Directional Repeat: 同向/直接重复)n9bp IR (Inverted Repeat: 反向重复)p复制起点的这些特征有利于在该位点快速解链以发动复制和促进 DNA聚合酶的结合复制起点的结构特征3.1.5 DNA复制的引物是RNA -- 证实实验之1M13噬菌体DNA侵染大肠杆菌E.coli并利 用其中的酶等进行复制+链+链 - 链复制型（RF型）DNAE.coli: Rif s ( 利福平敏感)加入：利福平 培养接种M13噬菌体无 RF型E.coli: Rif s ( 利福平敏感)加入：利福平培养接种M13噬菌体有 RF型E.coli: Rif r ( 利福平抗性)加入：利福平 培养接种M13噬菌体有 RF型（以上实验证实M13DNA的复制需要RNA的合成）（该实验证实当复制已经启动后，RNA分子合成与否不会影响复制的进行）3.1.5 DNA复制的引物是RNA -- 证实实验之2用32P标记复制引物复制，合成冈崎片段DNase Ⅰ酶切菌株RNaseH基因型 a, e; c, g- 无RNaseHb, f; d, h+ 有RNaseH复制引物p前导链合成的引物：由RNA聚合酶引导合成的RNA（证据：实验之1）（见复制的转录激活）p后随链合成的引物（冈崎片段合成的引物）：由引物酶 催化合成的RNA。
n引物酶不同于转录中的RNA聚合酶n引物酶由dnaG基因编码n引物在完成冈崎片段合成后被降解冈崎片段之间的缺口 有DNA聚合酶Ⅰ和DNA连接酶通过缺口平移的方式填补引物的去除和冈崎片段的连接3 ’5’OHOH复制的转录激活3.1.6 复制的过程p起始：引发体的形成p延伸：复制体形成以及单脱氧核糖核苷酸的添加导致新链的延长p终止：子代双链分子的分离引发体：在复制起点由多种不同的相关蛋白组合成引发前体后结合 引发酶而形成的复合物引发前体 Preprimosome起始：引发体的形成E.coli DNA 复制体的形成和新链的延伸复制的终止和子代分子的分离n终止：Tus蛋白+终止陷阱n子代分离：拓扑异构 酶IV；XerCD蛋白（位点特异的重组酶）3.2 复制的模式pθ复制 （ θ model）p滚环滚环 复制（Rolling-circle replication）pD-环环复制（Displacement-loop model）3.2.1 新起始复制方式 （de nova initiation）注：红色线条表示反射性同位素标记的新链，经过放射自显影后可在感光胶片上显示出来Cairns, J.P.: Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 28:44, 1963. 3H3H3H3HABCBAC3Hθ复制/凯恩斯模型 （ θ model/Cairns model）新起始方式的主要特征p每次复制均从一个固定的复制起点起始p前导链连续合成，后随链由冈崎片段连接而成SV40的复制真核生物DNA的复制3.2.2 滚环复制 Rolling-circle Model前导链滞后链滚环复制的特征p复制起始时，复制起点的一条单链断裂，而释放出5’端和3’端。
p3’端作为前导链合成的引物，前导链连续合成5’端游离出来，作为后随链合成的模板p在旺盛合成时期，前导链不断合成，且连在一起形成多联体分支，并作为新的后随链合成的模板p前导链的合成不需要另外合成的RNA引物3.2.3 D-环复制 （D-loop Model ）（线粒体DNA ）D-环复制的特征p环状DNA模板的两条单链的复制起点位置不同且相距甚远p复制起始首先在一条单链的复制起点起始，单向、连续合成前导链，并置换另一条模板单链p当另一条单链的复制起点暴露后，起始后随链的单向、连续的合成p两条链的复制完成有先后3种复制方式的主要差异新起始方式 （从头合成方式，θ复制 ）滚环复制D-环复制前导链连续合成连续合成，其模板保持环状； 始终与后随链模板共价连接连续合成后随链不连续合成不连续合成，其模板游离形成 线性分支连续合成复制起点固定，同一个位点固定，同一位点固定，不同位点 引物RNA分子前导链：后随链模板的3’端； 后随链：RNARNA3.3 避免线性DNA复制时末端缩短的机制环状DNA的复制不存在末端缩短的问题3’突出末端缺口5’3’缺口线性DNA复制后出现5’末端缩短T7噬菌体通过形成共联体避免5’末端缩短冗余末端冗余末端RNaseⅢ切点RNaseⅢ切点RNaseⅢ错位切割共联体腺病毒-2：末端起始复制SSB：单链结合蛋白TP：末端结合蛋白pTP：末端结合蛋白前体腺病毒-2：单链置换式复制红色 单链 的复 制起 始蓝色单链复制起始真核生物避免末端缩短的机制p现象：n1930s, 果蝇和玉米中，染色体末端缺失时，会出现两个姊妹染色体在末端融合；而在正常染色体中不会发生末端的融合。
n1938，Muller推测染色体末端存在一种特殊结构，对未出染色体的稳定性由重要作用 – 即后来称为“端粒”的结构n1984，Blackburn, E.研究组发现四膜虫rDNA末端在小核阶段没有重复片段 ，但在发育成大核后rDNA末端出现了370~520bp的（GGGGTT）n的重复序列 推测在发育过程中添加了此重复序列该推测通过加尾实验验证端粒的发现和证实加 尾 实 验 1984，Shampay，J & Blackburn, E自 主 复 制 序 列结论：四膜虫rDNA染色体末端 的确可以在发育中延长加 尾 实 验（续）结论：不管染色体末端的来源何在，其延长部分的序列由宿主细胞决 定这暗示细胞内具有特殊的结构和机制来控制染色体末端的延长加尾实验（续）p通过在酵母中的加尾实验证明：染色体末端在复制过程中可以被延长延长的末端序列由宿主酵母决定，即细胞中有特殊的结构或机制控制末端的延长p进一步的加尾实验：n四膜虫末端重复在体外的四膜虫细胞提取液中进行加尾实验n酵母的末端重复在体外的四膜虫细胞提取液中进行加尾实验n两个实验的结果：均出现加尾，且延长的尾巴与四膜虫的染色体末端重复一致n但是，四膜虫末端重复的互补序列在上述体系中不能加尾。
末端的延长是DNA合成过程，原有的序列是合成的引物而不是模板p端粒和端粒酶：大多数真核生物端粒（Telomere）：真核生物中由染色体末端的短重复序列和相关蛋白质组成的特 殊结构，对维持染色体的稳定性起着重要作用端粒酶（端粒末端转移酶 Telomere terminal transferase）: 真核生物特有的维持端粒完整性的酶，含有特定的小分子RNA 分子通过端粒复制避免末端缩短3’3’3’3’当端粒酶催化合成足够长的G链后，G链回折形成Hoogsteen结构，且末端和另一链的末端连接，形成封闭的染色体末端CCCAACCCCAACC………GGGG…GGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG…G=G Hoogsteen结构G链端粒长度与细胞“年龄”相关3.4 真核生物和原核生物复制的特征和复制调控3.4.1 原核生物的复制特征p单复制子p营养充足时，可在一个复制子内起始多次复制第一次复制的复制叉第二次复制的复制叉3.4.2 真核生物复制的特征p多复制起点和多复制子p复制的不一致性n同一个细胞中不同复制子起始复制的早晚差异n不同组织细胞复制的早晚差异n复制子的数量和复制速度随着细胞、组织和发育时期不 同而有差异p只有当所有的复制子完成复制后，才能在起始点上起 始下一次的复制；而且，真核生物的复制严格控制在 S期，一次分裂复制一次。
p端粒酶 ： 避免染色体末端缩短的机制3.4.3 复制的调控 主要是对复制起始的控制p原核生物：n甲基化对复制的调控：nCol E1质粒：反义RNA对复制的负调控p真核生物：n正调控n负调控GATC CTAGCH3CH3第一次复制GATC CTAGCH3半甲基化OriC全甲基化OriCGATC CTAGCH3CH3Dam甲基化酶起始第二次复制 全甲基化OriC甲基化对复制的控制：Dam甲基化酶—对GATC位点的甲基化DnaA蛋白--识别全甲基化的复制起点质粒ColEⅠ：反义RNA对复制的调控引物前体500ntRNaseH: 降解引物前体RNA使之3’-OH暴露反义RNA复制起点n 反义RNA的合成以及它与引物前 体的结合阻止了RNaseH的作用；n 反义RNA的浓度决定了胞内有效 引物的浓度，从而影响复制的起始 引物前体转录起点反义RNA转录起点-555 -445Rop基因表达Rom：在反义RNA存在的前提下，负调控复制 起始n 引物前体 100~220nt: 抑制其继续合成n引物前体 220~360nt: 反义RNA与引物前体 互补n 引物前体 〉360nt: 起始复制Rom由G1期积累的执照因子参与的正调控负调控：G2期积累增殖蛋白，它能够阻止Mcm因子装配到新合成的DNA上而防止同一细胞周期内的重复复制起始。
真核生物复制只在S期进行G1期S期G2期。