SouthernBlot原理及实验方法SouthernBlot原理及实验方法原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将标记物标记的DNA或RNA探针进行反应如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态,如是否有点突变、扩增重排等其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它试剂和器材一、试剂变性液：1.5mol/LNaCl，0.5mol/LNaOH中和液：0.5mol/LTris-HCl(pH=7.5)，1.5mol/LNaCl20DSSC：3mol/LNaCl，0.3mol/L柠檬酸钠以上溶液均在100Kpa灭菌20分钟2DSSC：用无菌移液管吸取20DSSC溶液5mL，加无菌水45mL6DSSC：用无菌移液管吸取20DSSC溶液15mL，加无菌水75mL二、器材22CmD15Cm瓷盘操作方法1. 在琼脂糖凝胶上电泳分离相（放一标尺，可从像片中读出2. 将凝胶置于200mL变性液中，浸泡变为ss-DNA，然后用重蒸水冲洗凝胶几次。
3. 用中和液浸泡凝胶并不断地振荡纤维膜4. 取一个瓷盘，在底部放一块玻璃板DNA取出凝胶，切去边缘多于部分，DNA迁移的距离）45分钟，并温和地不断振荡，使凝胶上的45分钟，将凝胶中和至中性或一块海绵）使盛器内的板表面，在玻板表面盖一张3mm的二号滤纸，滤纸两边浸没于EB染色，在紫外灯下照防止凝胶的碱性破坏硝酸ds-DNA转20倍SSC转移滤液低于玻20倍SSC溶液中，在玻璃和滤纸之间，赶掉所有的气泡5.把凝胶底面朝上放在滤纸上，赶走两层之间出现的气泡6.裁剪一张硝酸纤维膜，其长与宽大于凝胶先把它放在去离子水中润湿后，再放在两层之间不可有气泡i—2mm,并在角上作记号，以确定滤膜方位20倍SSC溶液中润湿5分钟，然后放在凝胶表面，7.然后再把两张与滤膜一样大小的二号上，同样要把气泡赶走滤纸，在2倍SSC溶液中浸湿，覆盖在硝酸纤维膜8.把一叠吸水纸(或卫生纸，约有5—8cm高，略小于滤纸)，放置在滤纸上，在吸水纸上再放一块玻璃板和重约500g的重物，放置过夜9.转移结束后，移去上面的吸水纸和滤纸，同时翻转取出凝胶与硝酸纤维膜，把凝胶的点样与硝酸纤维膜的相对应位置用铅笔或解剖针的针尖做好标记。
11.把已转移了DNA的硝酸纤维膜放在6倍SSC溶液中振荡浸泡5分钟，然后放在滤纸上吸干溶液再把它夹在两层滤纸之间,80□真空干燥2小时注意事项(1) 将凝胶中和至中性时，要测pH,防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜2) 要注意赶走凝胶和滤纸及硝酸纤维素膜之间的气泡Southern杂交简介：Southern杂交是分子生物学的经典实验方法其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂PCR产物判断等研究中Southern杂交DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该交信号通过Southern杂交可以判断被检测的片段的长度该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA指纹分析和但由于该技术的操作比较烦琐、费时，所以现在有一些其他的方法可以代替但该技术也有它的独特之处，是目前其他方法所不能替代的，如限制性酶切片段的多态性(RFLP)的检测等一、基因组DNA的制备二、基因组DNA的限制酶切根据实验目的决定酶切DNA的量一般Southern杂交每一个电泳通道需要10-30pg的DNA购买的限制性内切酶都附有相对应的10倍浓度缓冲液，并可从该公司的产品目录上查到最佳消化温度。
为保证消化完全，一般用2—4U的酶消化1pg的DNA消化的DNA浓度不宜太高，滤纸，以0.5pg/pl为好由于内切酶是保存在50%甘油内的，而酶只有在甘油浓度<5%的条件下才能发挥正常作用，所以加入反应体系的酶体积不能超过1/10DNA(1pg/pl)20pg10H酶切buffer4.0pl具体操作如下：在1.5ml离心管中依次加入限制性内切叮10U/p1)5.0pl加ddH20至50p1在最适温度下消化1-3hr消化结束时可取5p1电泳检测消化效果如果消化效果不好，可以延长消化时间，但超过6hr已没有必要或者放大反应体积，或者补充酶再消化如仍不能奏效，可能的原因是DNA样品中有太多的杂质，或酶的活力下降消化后的DNA加入1/10体积的0.5MEDTA，以终止消化然后用等体积酚抽提、等体积氯仿抽提，2.5倍体积乙醇沉淀，少量TE溶解（参见DNA提取方法，但离心转速要提高到12000g,以防止小片段DNA的丢失）如果需要两种酶消化DNA，而两种酶的反应条件可以一致，则两种酶可同时进行消化；如果反应条件不一致，子强度，再加第二种酶进行消化则先用需要低离子强度的酶消化，然后补加盐类等物质调高反应体系的离三、基因组DNA消化产物的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是目前分离核酸片段最常用的方法，制备简单，分离范围广（200bp-50kb），实验成本低。
下表列举了不同浓度琼脂糖凝胶能分离的DNA片段范围表：不同浓度琼脂糖凝胶分离DNA片段的范围琼脂糖凝胶浓度（%）分离DNA片段范围（kb）0.35-600.61-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-32.00.1-21.制备0.8%凝胶：一般用于SouthernDOODODO0.8%DNAMarker2.DO：电泳样品中加入6DLoading缓冲液，混匀后上样，留一或两泳道加l-2V/cm,DNA从负极O向正极电泳至溴酚蓝指示剂接近凝胶另一端时，停止DO取出凝胶，紫外灯下观察电泳效果在胶的一边放置一把刻度尺，拍摄照片正常电泳图谱呈现DNA长度一连续的涂抹带，照片摄入刻度尺是为了以后判断信号带的位置，以确定被杂交的四、DNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持物DNA真空法和电转转移就是将琼脂糖凝胶中的DNA转移到硝酸纤维膜卩NC膜）或尼龙膜上，形成固相转移的目的是使固相DNA与液相的探针进行杂交常用的转移方法有盐桥法、移法这里介绍经典的盐桥法（又称为毛细管法）一）试剂准备叮变性液：0.5MNaOH；1.5MNaClD叮中和液：0.5MTris-HCl（pH7.4）；1.5MNaCl;7.0，加ddH2ODDDOOD20DSSCD：NaCl175.3g;柠檬酸三钠82.2g,NaOH调pH至至1000ml。
二）操作步骤1.碱变性:室温下将凝胶浸入数倍体积的变性液中30min2.中和:将凝胶转移到中和液15min3．转移按凝胶的大小剪裁NC膜或尼龙膜并剪去一角作为标记，水浸湿后，浸入转移液中5min剪一张比膜稍宽的长条Whatman3mm滤纸作为盐桥，再按凝胶的尺寸剪大量的纸巾备用按下图所示进行转移转移过程一般需要8-24hr,每隔数3-5张滤纸和hr换掉已经湿掉的纸巾转移液用20DSSCD注意在膜与胶之间不能有气泡整个操作过程中要防止膜上沾染其他污物4.转移结束后取出NC膜，浸入60SSC溶液数min,洗去膜上沾染的凝胶颗粒，置于两张滤纸之间，80°C烘2hr,然后将NC膜夹在两层滤纸间，保存于干燥处五、探针标记进行Southern杂交的探针一般用放射性物质标记或用地高辛标记放射性标记灵敏度高棉纱，效果好；地高辛标记没有半衰期，安全性好这里介绍放射性标记探针的标记方法有随机引物法、很简单切口平移法和末端标记法，有一些试剂盒可供选择，操作也以下为Promega公司随机引物试剂盒提供的标记步骤：□取25-50ng模板DNA于0.5ml离心管中,100叮性2□在另一个0.5ml离心管中加入：5min,立即置冰浴。
Labeling5Dbuffer10|jl（含有随机引物）dNTPmix2jl（含dCTP、dGTP、dTTP各0.5mM）BSA（小牛血清白蛋白）2jl[a-32P]dATP3jlKlenow酶5U3叮变性模板DNA加入0000,0ddH20至50jl,混匀室温或37卩1hr4．加50jl终止缓冲液终止反应标记后的探针可以直接使用或过柱纯化后使用由于好的探针应尽快使用探针的比活性最好大于六、杂交a-32P的半衰期只有109计数/分/jl14天,所以标记即探针为液相,被杂交DNA为固相杂交发生Southern杂交一般采取的是液-固杂交方式,于一定条件的溶液（杂交液）中并需要一定的温度,可以用杂交瓶或杂交袋并使液体不断的在膜上流动杂交液可以自制或从公司购买,不同的杂交液配方相差较大,杂交温度也不同下面给出的为一杂交液配方：PEG600010%；SDS0.5%；6DSSC；50%甲酰胺该杂交液的杂交温度为42DD1．预杂交NC膜浸入2DSSC05min,在杂交瓶中加入杂交液（8CmD8Cm的膜加5ml即可），将膜的背面贴紧杂交瓶壁，正面朝向杂交液放入42□杂交炉中，使杂交体系升到42□取经超声粉碎的鲑鱼精DNA]已溶解在水或TE0D100D0DD05min,迅速加到杂交瓶0,使其浓度达到100jg/ml。
继续杂交4hr鲑鱼精DNA的作用是封闭NC膜上没有DNA转移的位点，降低杂交背景、提高杂交特异性2．杂交倒出预杂交的杂交液，换入等量新的已升温至42□的杂交液，同样加入变性的鲑鱼精DNA将探针100叮热5min,使其变性，迅速加到杂交瓶中42卩杂交过夜七、洗膜与检测取出NC膜，在2DSSC溶液中漂洗5min,然后按照下列条件洗膜：2DSSC/0.1%SDS,42D,10min；1DSSC/0.1%SDS,42D,10min；0.5DSSC/0.1%SDS,42D,10min；0.2DSSC/0.1%SDS,56D,10min；0.1DSSC/0.1%SDS,56D,10min在洗膜的过程中，不断振摇，不断用放射性检测仪探测膜上的放射强度实践证明，当放射强度指示数值较环境背景高1-2倍时，是洗膜的终止点上述洗膜过程无论在哪一步达到终点，都必须停止洗膜洗完的膜浸入2DSSC中2min,取出膜，用滤纸吸干膜表面的水份，NC膜之间不能有气泡将膜正面向上，放。