实验二蛋白质分子量的测定一一凝胶层析法一、原理凝胶层析法是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，又叫分子 筛层析法，排阻层析法凝胶本身是一种分了筛，它可以把分了按大小不同的进 行分离，如同过筛可以把大颗粒与小颗粒分开来一•样但是这种“过筛”与普通 过筛不一样将凝胶颗粒在适宜溶剂中浸，使充分洗液膨胀,然后装入层析柱中， 加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中，大分子不能进入凝 胶内部而言凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速 缓慢，以致最后流出柱外，而使样品分了不同的分了得到分离凝胶室又叫退溶液凝结而成的固体物质，不论是天然还是人工合成凝胶，他 们的内部都具有很多和微细的多孔网状机构，凝胶层析法常用天然凝胶是琼脂凝 胶，人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶，和葡萄糖凝胶，具有不同孔隙度的立体 网状结构的凝胶，不溶于水这种聚合物的立体网状结构，起孔隙代销与被分离 物质分了的大小有相似的数量级，在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只 能有相应的小分子可以通过，适用于分离小物质相反，交联度低的孔隙大，适 用于分离大分子的物质利用这种性质可分离不同分子量的物质。
以下进一步来说明凝胶层析的原理将凝胶装在柱子里，柱床体积称为总体 积，以Vt表示实质上Vt是由Vo、Vi与Vg三部分组成，既Vt=Vi+Vg+VOo Vo 称为孔隙体积或者外体积，又称为外水体积，即存在于柱床内凝胶克里外面孔隙 之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内部流动相的体积；Vi为内部体积，济 宁叫颗粒内部所含水相的体积，因此Vt-Vo=Vi+Vg脱洗体积与Vo及Vi之间的关系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi式子中的Ve为脱水体积，自加入样品时算起，到祖坟最大浓度出现时候流 出的体积，Kd为样品组分在二相间的分配系数它只与被分离物质分了的大小 和凝胶颗粒孔隙的大小分布冇关，与柱的长短粗细无关，也就是说他对每一个物 质为常数与柱的物理条件无关Kd可以通过实验室求得上式子可改写成：Kd= (Ve-Vo)/Vi, Vo表示外体积；Vi内体积；Veil、Velll分别代表组分II和III的洗脱 体积Kd可以冇下列几种情况：1、当Kd二0时，则Ve=VOo即对于根木不能进入凝胶内部的大分了物质(全 排阻），洗脱体积等于空隙体积2、 当Kd"时，Ve=Vo+Vio即小分了可完全渗入凝胶内部时，洗脱体积应为 空隙体积与内体积之和。
可以看出，对某一凝胶介质，两种全排出的分子即Kd 都等于零，虽然分子大小有差别，但不能有分离效果同样两种分子如都能进入 内部空隙，即Kd都等于1,它们即使分子大小冇不同，也没冇分离效果因此 不同型号的凝胶介质，有它一定的使用范围3、 当0l时，表示凝胶对组分有吸附作用，此时Ve>Vo+Vio例如一些 芳香族化合物的洗脱体积远超出理论计算的最大值，这些化合物的Kd>lo如苯 丙氨酸,络氨酸和色氨酸在Sephadx G-25中德Kd值分别为1.2, 1.4和2.2在实际工作中，对小分子物质也得不到Kd二1的数值，特别是交联度大的凝 胶差别更大，如用G・10型得Kd值0.75左右，用G・25型得0.8左右这是由于 一部分水相与凝胶结合较牢固，成为凝胶本身的一部分，因而不起作用，小分子 不能扩散入内所致此时Vi即不能以g-WR计算，为此也常冇直接用小分子物 质D20, NaCI等通过凝胶柱而由实验计算出Vi值的另一个解决的办法是不使 用Vi与Kd,而用Kav （有效分配系数）代替Kd,其定义如下：已知 Kd= Ve-VoVi, Vt-Vo 代替 Vi,则：Kav二Ve・Vo/Vt・Vo 即 Va=Vo+Kav（Vt-Vo）在这里实际上将原来以水作为固定相（Vi）改为水与凝胶颗粒Vt・Vo作为固 定相，而洗脱剂（Ve・Vo）作为流动相。
Kav与Kd对交联度小的凝胶差别较小， 而对交联度大的凝胶差别大在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用时，当流动相流动Vt体积后，所 有的组分都应该被洗出来，只一点为凝胶层析法的特点，与一般层析方法不同Ve与分子量的关系：对同一类型的化合物，洗脱特性与组分的分子量有关， 流过凝胶柱是，按分子量大小顺序流出，分子量大的走在前而Ve与分子量的 关系可用卜式表示：Ve=KrK2logM K1与K2为常数，M为分了数，Ve也可 用Ve・V分离体积）,Ve/Vo相对保留体积，Ve/Vt （简化的洗脱休积，它受柱的填 充情况的影响较小）或Kav代替，与分子量的关系同上式，只是常数不同通常 多以Kav对分子量的对数作图得一曲线，称为“选择曲线”曲线的斜率是说明 凝胶性质的一个很重要的特征在允许的工作范围内，曲线越陡，则分级愈好, 而工作范围愈窄凝胶层析主要决定与溶质分了的大小，每一类型的化合物如球 蛋片类，右旋糖酊•类等都冇它自己的特殊的选择曲线，可用以测定未知物的的分 子量，测定吋以便用曲线的直线部分为宜用凝胶层析法测定蛋口质的分子量，方法简单，技术易掌握，样品用量少, 而冃冇时不需耍纯物质，用一粗制品即可。
例如在一粗酶制剂中，为了测定某一 酶组分的分了量，只要测定脱洗液中具有该酶最大活性的部分，然后确定其洗脱 体积，即口J从标准曲线中查出其分子量凝胶层析法测定分子量也冇一淀的局限 性，在pH6-8的范围内，线性关系比较好，但在极端pH时，一•般蛋白质有可能 因变性而偏离糖蛋白在含糖量超过5%时，测得分子量比真实的要小有一些 酶底物是糖，如淀粉酶，溶菌酶等会与葡聚糖胶形成络合物，这种络合物与酶底 物络合物相似，因此在葡聚糖凝胶上层析时表现异常，用凝胶层析法所测分了量 的结果，要和其他方法的测定相对照，由此才可作出可靠的结论凝胶层析技术操作方便，设备简单，周期短，重复性能好，而且条件温和, 一般不引起生物活性物质的变化，目前以得到相当广泛的应用，例如可用于脱盐, 浓缩高分子物质的分子量下而实验是利用葡聚糖凝胶层析法测定蛋白质的分子 量二、试剂和器材【试剂】1＞标准蛋白质：蓝色葡聚糖-2000 (200KD),牛血清血蛋白(67KD),胃蛋 白酶(36KD), CytC(13・7KD)等,均为分析纯2、 洗脱液：0.2mol/LTris-HCI-KCI, pH7.5取 0.5M KCI 20ml, 0.2M Tris 25ml, 0.1M HCI 40.3ml,再加 H2O 定容至 100ml3、 Sephadex G-75 (或 G-100)o【器材】1＞层析柱：柱管1.2 X 50cm o2、 核酸蛋白检测仪(或紫外分光光度计)。
3、 部分收集器4、 刻度试管三、操作方法与结果（一）凝胶柱的准备1、 凝胶的选择和处理⑴凝胶的选择：凝胶型号很多型号不同，筛分范围亦不同市售的Sephadex 的分离范围，常用高聚糖或球蛋口测定Sephadex G型一般适宜于分离蛋口质 如果用丁分离核糖时，则限于英空间结构和所带基团的影响，选用高于它们分子 量范围的型号，或者选用适当型号的生物胶和Sephacrylo在去除蛋白质溶液中 的盐类时，口J选用凝胶Sephadex G-25.当溶液通过G・25柱吋，蛋白质被排阻在凝 胶外面先流出来，而盐类则扩散到凝胶网孔里后流出来，这样就使蛋白质得到纯 化一般说来，在规定的筛分范围内，混合物之间量差别越大，分离效果越好[2]凝胶的处理：葡聚糖凝胶是以干粉保存的，因此使用前必须将干凝胶浸 泡于将要做洗脱剂的相同液体中，充分溶胀，然后才能使用根据层析柱的体积 和所选用的凝胶，膨胀后床体积，计算所需凝胶干粉的重量，将称好的干粉倾入 过量的洗脱液中，一般为水、盐溶或缓冲液，放置在室温，使之充分吸水溶胀 注意不要过分搅拌，以防颗粒破碎浸泡时间根据凝胶交联度不同而杲为了缩 短溶胀时间，可以在沸水浴上加热至将近100C,这样可大大缩短溶胀时间至几 小时，而且还可杀死细菌和霉菌和排除凝胶内部包藏着的气泡。
但是，必须避免 置于酸或碱溶液中加热凝胶颗粒最好大小比较均匀，这样流速稳定，结果较好如果颗粒大小不匀， 可以在浸泡时用倾泻法将不易沉下的较细的颗粒倾去装柱前最好将处理好的凝 胶置真空干燥器中抽真空，以除尽凝胶中的空气2、 凝胶柱的制备⑴柱的选择：层析柱是所有层析方法的主要组成部分因此，对层析柱（包 括体积和长度等）选择的合理与否，将直接影响分离效果当用同样直径的层析 柱分离两种以上的物质时，长层析柱比短的分辨率高；当用同样长度的层析柱分 离两种以上的物质时，层析柱直径大的比小的分辨率高；当用同样体积的层析柱 分离两种以上物质吋，仍吋层析柱长的比短的分辨率高一般理想的层析柱之直 径和长度之比是1： 25〜100层析柱最好有架套，这样温度可以控制，得到的 结果可以重复⑵装柱：层析柱必须粗细均匀，柱管大小可根据实际需要选择一般柱直 径（半径）为lcm,如果样品样比较多，最好用直径2・3cm柱但若直径太小时 会发生“壁管效应”，即在柱管中心部分组分移动较慢，而在管壁周围移动较快， 因而影响分离效果一般说来，柱越长，分离效果愈好，但柱过长，实验吋间长， 而且样品稀释度大，易扩散，分离效果反而不好。
一般来说，用于脱盐时，柱高 50cm比较合适；在进行分级分离时，100cm高就已足够装柱方法与一般柱层析法相似，柱管可用一般柱层析管，柱的卜-端缩口，底 部廿前常用多孔的聚乙烯片做底板底下用棉花或玻璃纤维填弃如用烧结玻璃 砂板做底，尽管用细孔的（3号），粗孔的则要在其上铺一层滤纸或尼龙滤布 先加适量溶剂到柱内，排走其中的空气，然后把预先用溶剂浸泡好的凝胶搅匀, 随即将此悬浮液连续倾入柱内，待其自然沉降金柱高的1/4〜1/3时•，打开柱下 端出丨I,让溶剂慢慢流入，使柱上端悬浮液面缓慢卜•降至需耍的高度耍注意颗 粒间没冇夹杂气泡，最好不用分次填装法或稀的凝胶悬浮液装柱凝胶沉集后，将溶剂放出，再通过2・3倍柱床体积的溶剂使柱床稳定，然后 在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防在加样时凝胶被冲起来耍注意在任何时候不耍使液而低于凝胶表而，否则水分挥发，凝胶变干，分 离效果变坏，并有可能混有气泡，影响液体在柱内的流动3、 加样：加样量与测定方法和层析柱大小冇关测定样品含量的方法灵敏 或床柱体积小吋，加样量可少否则反之例如，一般测定蛋白质的含量多用紫 外分光光度法当采用280nm观察消光读数时，加样量需5mg左右（柱体积2 X60cm）；当采用220nm观察消光读数时，加样量只需要左右。
加样量 掌握得当，可提高分离效杲一般来说，加样量越少，或加样体积越小（样品浓 度高），分辨率越高但用于样品的制备和脱盐时，加样量应在不影响分辨率的 前提下增大此外，样詁的粘度也影响层析的分辨率，样品的粘度大比小分辨率 低因此，一般使用的样品粘度应小于2,或者与洗脱液的粘度相当为宜加样的方法与一般柱层析法相同，将柱中多余的液体放出后，将样品溶液小 心加到凝胶柱上，打开管夹,使样品溶液流入柱内然后加入溶剂或盐溶液洗脱4、 洗脱：所有洗脱液均以能溶解洗脱物质和不使其变性或失活为原则洗 脱用的液体应与浸泡膨胀凝胶所用的液体相同，否则由于更换溶剂，凝胶体积发 生变化而影响分离效果洗脱所用的液体冇水（多用于分离不带电荷的中性物质） 及电解质溶液（用于分离带电基团的样品），如酸、碱、盐的溶液及缓冲液等 对于吸附较强的组分，也有使用水与冇机溶剂的混合液，中水■甲醇，水■乙醇, 水•丙酮等，如以此作为洗脱剂，可以减低吸附，将组分分洗下洗脱吋的流速 要严格控制否则收集的每一部分洗脱体积。