豆乳蛋白聚集体的形成与 蛋白粒子的结构中国农业大学食品科学与营养工程学院郭顺堂 E-mail: shuntang@豆乳基础研究的必要性豆乳是大豆加工的重要产品，也是重要的中间原料大豆加工大豆切片透过型电子显微镜照片斎尾 (1986)大豆βConglycinin, Glycinin 分子量和等电点大豆蛋白质＊70% 是 7S, 11S Globulin＊其他为酶类和其他球蛋白b-conglycinin (7S)三量体Glycinin (11S) (Adachiら 2003)(Maruyamaら 1998)6量体中性脂质以 Oil body形式存在表面Oleosin 和磷脂Oil body 结构 （Huangら，1992 ）大豆中脂質Soymilk Process （中国・淮南图解）豆乳：含蛋白质、脂肪、多糖和低聚糖等胶体溶液STEP Ⅱ＞７５℃６５～７５℃STEP Ⅰ７Ｓ１１Ｓ生粒子 (380nm)ααα’βα’豆 乳蛋白粒子(80nm)ＢβOB様粒子Ａα Ａαα’Ｂβ可溶性subunitsＢβＢβＢβＢβB浮上可溶性粒子J. Agric. Food Chem. 1997, 45, 4601-4605生豆乳、豆乳中例子的分布1.6μm0.38μm生豆乳0.07μm0.38μm豆乳粒子 蛋白質Ｏｉｌ body加熱↓Formation of Tofu from Soymilk（Speculation）Ｂβ粒子 (80nm)OB様粒子Ａα Ａαα’Ｂβ７Ｓ１１Ｓ可溶性 subunit豆 乳PhytinαＡＡα’Ｂβ ＢβＢβＢβ ＢβＢβＢβ ＢβＢβＢβ ＢβＢβ α’ＡαＡＡＡα’α’α’Ｂβ ＢβＢβＢβ ＢβＢβＢβ ＢβＢβＢβ ＢβＢβＢβ ＢβＢβＢβ ＢβＢβＢβ ＢβＢβ豆 腐 Ca2+,Mg2+添加pH降低 凝 集J. Agric. Food Chem. 1999, 47, 901-905 JOURNAL OF FOOD SCIENCE 2002—Vol. 67, Nr. 9, 3215 JOURNAL OF FOOD SCIENCE 2005—Vol 70, Nr. 4, C258蛋白粒子研究的意义o 豆乳蛋白粒子数量、大小和结构直接影响豆乳的稳 定性、凝胶形成性以及干燥成粉后产品的溶解性。
o 改变豆乳中蛋白质的结构和功能特性是解决豆乳及 其制品加工技术创新的根本o 在分子水平上豆乳中蛋白粒子的形成机制和结构特 征还不清楚o 对蛋白粒子进行更有针对性的结构修饰获得或改善 豆乳的某一种加工特性 o 大豆乳清蛋白是否也参与了蛋白粒子的形成？o 蛋白粒子的立体结构是怎样的？o 能不能对蛋白粒子的形成加于控制并用于实际生产？乳清蛋白对蛋白粒子形成影响图1 大豆乳清蛋白对脱脂豆乳浊度的影响大豆乳清蛋白热导致粒子的粒径分布图2 加热大豆乳清蛋白分散液中蛋白粒子的粒径分布 DSM： 脱脂豆乳； HWSP：加热大豆乳清蛋白分散液 不同粒径大豆乳清蛋白粒子的组成Lane 1，marker, Lane 2，大粒子（非还原）,Lane 3，大粒子（还原）, Lane 4，中粒子（非还原）,Lane 5，中粒子（还原） ，Lane 6，非粒子（非还原）, Lane 7，非粒子（还原）图3不同粒径大豆乳清蛋白粒子的还原和非还原SDS-PAGE图谱 注：大粒子，＞200 nm；中粒子，40-200 nm；非粒子，＜40 nm大豆乳清蛋白粒子中各蛋白分子间的结合方式 图4 热导致大豆乳清蛋白粒子的2D-SDS -PAGE 图谱图5 热导致大豆乳清蛋白非粒子的2D- SDS-PAGE 图谱大豆乳清蛋白形成蛋白粒子的温度图6 不同温度加热的大豆乳清蛋白 分散液中非粒子蛋白的组成分析 图7 大豆乳清蛋白的DSC分析 图谱凝集素的热聚集图8 凝集素形成蛋白粒子的SDS-PAGE图谱 Lane 1，marker；lane 2，大豆乳清蛋白（ WSP）；lane 3，80℃加热WSP的非 粒子部分，lane 4，80℃加热WSP非粒 子部分再经95℃加热10 min后的非粒子部分；lane 5，80℃加热WSP非粒 子部分经95℃加热10 min 后形成的粒子。
加热对大豆乳清蛋白溶解性的影响 lane 1, 分子量标准蛋白； lane 2，自然pH下的生豆 乳； lane 3，熟豆乳在pH4.5时 的上清； lane 4, 生豆乳在pH 4.5 的 上清(WSP)图9 生豆乳乳清和熟豆乳乳清中蛋白的SDS-PAGE图谱 o 大豆乳清蛋白加热后，其中的脂肪氧化酶、β-淀 粉酶和凝集素倾向形成蛋白粒子，而胰蛋白酶抑制剂不易形成粒子o 粒子中脂肪氧化酶和β-淀粉酶主要通过二硫键形成聚集体，而凝集素通过非共价键结合在粒子中o 脂肪氧化酶和β-淀粉酶在75℃以下形成粒子，凝 集素在85℃以上形成o 大豆乳清蛋白可能会与其他蛋白作用形成粒子大豆乳清蛋白与7S混合加热对蛋白粒子形成的影响o 明确大豆乳清蛋白是否与7S发生了相互作用而形成复合蛋白粒子o 明确形成的蛋白粒子的表面性质及各成 分的结合方式7S与大豆乳清蛋白热聚集作用WSP：不同浓度的大豆乳清蛋白7S+WSP：5mg/mL 7S和不同浓度的大豆乳清蛋白的混合物图10 不同浓度大豆乳清蛋白及其与7S球蛋白混合分散液经加热处理后的浊度 7S对大豆乳清蛋白形成粒子的影响WSP：不同浓度的大豆乳清蛋白7S+WSP：5mg/mL 7S和不同浓度的大豆乳清蛋白的混合物。
图11 WSP单独加热和WSP与7S混合加热时大蛋白粒子的含量 大粒子：指能被1万g离心10min沉降的蛋白粒子，直径＞200nm图12 HCG、HWSP 和 HM 的1万g离心上清的凝胶层析图 HCG：加热β-伴大豆球蛋白分散液；HWSP：加热大豆乳清蛋白； HM：两者以1/1混合后加热 7S和大豆乳清蛋白在不同钙离子浓度时的溶解性■，加热WSP(HWSP)；●，加热7S(HCG) ；▲，HWSP和 HCG1/1混 合(MH)；▼，WSP和7S以1/1混合后加热(HM) 图13 混合加热和单独加热蛋白分散液在不同钙离子浓度下的蛋白溶解性 大豆乳清蛋白与7S蛋白混合加热后的蛋白粒径分布■，加热7S (HCG)；◆，加热大豆乳清蛋白 (HWSP)：▲，7S和WSP以4/1混合加热 (HM) 图14 不同蛋白分散液中蛋白粒子的粒径分布 蛋白粒子与非粒子的蛋白组成lane 1, 分子量标准蛋白； lane 2, 4, 6, 分别为HCG, HWSP, HM 中的粒子蛋白； lane 3, 5, 7, 分别为HCG, HWSP, HM 中的非粒子蛋白图15 蛋白粒子和非粒子的蛋白的SDS-PAGE图谱 各蛋白分散液在不同温度下的蛋白粒子形成量■，加热7S (HCG)；◆，加热大豆乳清蛋白 (HWSP)：▲，7S和WSP以4/1混合加热 (HM) 。
图16 加热温度对蛋白粒子的形成的影响 n 大豆乳清蛋白的脂肪氧化酶、β-淀粉酶与7S产生热变性反应并发生相互作用而形成复合蛋白粒子n 更多7S的α, α′亚基与大豆乳清蛋白结合而形成蛋白粒子n 复合蛋白粒子的表面性质与7S接近，说明7S可能结合于由脂肪氧化酶、β-淀粉酶通过二硫键形成的蛋白粒子的外表面豆乳中蛋白粒子的结构特征o 明确以11S和7S为主要组分的脱脂豆乳蛋白粒 子的结构单元 o 明确蛋白粒子中各结构单元的结合位置及相 互之间的作用力性质脱脂豆乳中不同粒径蛋白粒子的组成图17 脱脂豆乳中不同粒径蛋白粒子的SDS-PAGE图谱 Lane 1，脱脂豆乳； lane 2，大粒子（＞ 200 nm）； lane 3，中粒子（40- 200 nm）； lane 4，非粒子（＜ 40 nm）； lane 5，marker蛋白粒子在不同试剂中的解离程度图18 蛋白粒子在不同缓冲液中的溶解性 TB，30 mM 的Tris- HCl 缓冲液（pH 8.0， 含0.02% NaN3）；TB + NaCl，TB中含 0.5 M NaCl；TB + 2-ME，TB中含 0.2 M 2-ME；TB + urea，TB中含6 M 脲；TB + urea + SDS，TB 中含6 M 脲和0.5% SDS 不同试剂中解离蛋白粒子的亚基组成Lane1，maker；lane 2，TB；lane 3, TB+NaCl;lane 4, TB+2-ME; lane 5, TB+SDS;lane 6, TB+SDS+urea; lane 7, 总蛋白粒子图19 蛋白粒子经不同溶剂处理后的溶出部分SDS-PAGE图谱 解离蛋白粒子的分子量分布及其结合方式图20 被TB + urea +SDS解离蛋白粒子的排 阻色谱图 图21 图20中S-500 不同洗脱峰的非 还原和还原SDS-PAGE图谱 Lane 1，2，3，分别为图20中F1，F2，F3的非还原电泳；lane 4，5 ，6，分别为图5-4中F1，F2，F3的还原电泳；lane 7，marker 不能被2-ME解离的蛋白粒子组成图22 未被TB + 2-ME解离的蛋白粒子的凝 胶层析图 图22 图21中各洗脱组分的非 还原和还原SDS-PAGE图谱 Lane 1，2，3，分别为图22中MF1，MF2，MF3 组分（非 还原）；lane 4，5，6，分别为图5-6中MF1，MF2，MF3 的还原处理；lane 7，marker NEM存在下形成蛋白粒子的分子组成图23 NEM存在时形成的蛋白粒子的凝胶 层析图 图24 图23中NF组分的非还原 和还原SDS-PAGE图谱 讨 论o 生豆乳中蛋白粒子主要由11S和7S构成（Ono et al,1991），而大豆乳清蛋白则溶解于生豆乳中。
o 加热到75℃时，蛋白粒子中的7S开始解离（Guo et al., 1997）大豆乳清蛋白的脂肪氧化酶和β-淀 粉酶开始聚集形成蛋白粒子o 当在95 ℃加热时，11S的碱性多肽和酸性多肽形成 二硫键结合的聚集体，并进一步形成蛋白粒子o 二硫键结合的碱性多肽位于蛋白粒子的内部，酸性 多肽和7S蛋白位于蛋白粒子的表面基于以上认识，我们提出豆乳中蛋白粒子 的结构模型，如下图所示。