•大肠杆菌的生物学特性大肠杆菌的生物学特性•大肠埃希氏菌习惯称为大肠杆菌，分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属，并且大肠杆菌株ATCC 11775是该属的模式菌种 •大肠杆菌的不同菌株间DNA相关性为80%，而与同科的志贺氏菌属（除鲍氏志贺氏菌外）的DNA相关性可达80-87%• 大肠杆菌为人和动物肠道中的常居菌，一般多不致病，在一定条件下可引起肠道外感染 •肠杆菌科有一些共同特性，比如都是革兰氏肠杆菌科有一些共同特性，比如都是革兰氏阴性小杆菌，好氧或兼性厌氧，没有芽孢阴性小杆菌，好氧或兼性厌氧，没有芽孢•大小0.4～0.7×1～3um,无芽胞,大多数菌株有大多数菌株有动力动力• 有普通菌毛与性菌毛，有些菌株有多糖类包膜，革兰氏阴性杆菌革兰氏阴性杆菌 •MOTILITY TEST•1. Pseudomonas aeruginosa（铜绿假单胞菌）：Motile 2. Staphylococcus aureus：Non-motile 3. Bacillus subtilis：Motile • • • •培养特性培养特性•由于此菌合成代谢能力强，在含无机盐、胺盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。
• 最适生长温度为37℃，在42-44℃条件下仍能生长，生长温度范围为15-46℃• 在普通营养琼脂上生长表现3种菌落形态：• （1）光滑型： 菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、光滑、呈灰色，在生理盐水中容易分散• （2）粗糙型：菌落扁平、干涩、边缘不整齐，易在生理盐水中自凝• （3）粘液型：常为含有荚膜的菌株•此菌兼性厌氧，在有氧条件下生长良好，最适生长pH为6.8-8.0，所用培养基pH为7.0-7.5,若pH值低于6.0或高于8.0则生长缓慢 • • •生化反应生化反应 • 大部分菌株发酵乳糖产酸产气，并发酵葡萄糖、麦芽胞、甘露醇、木胶糖、阿拉伯胶等产酸产气• IMViC试验试验为“+、+、-、-”即为典型大肠杆菌•抗原构造抗原构造 • 比较复杂，主要由菌体菌体O抗原、鞭毛抗原、鞭毛H抗原抗原、夹膜K抗原组成•抵抗力抵抗力 • 该菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强，55℃经60分钟或60℃加热15分钟仍有部分细菌存活• 在自然界的水中可存活数周至数月，在温度较低的粪便中存活更久对磺胺类、链霉素、氯霉素等敏感，但易耐药，是由带有R因子的质粒转移而获得的 •致泻性大肠杆菌简介致泻性大肠杆菌简介•大肠杆菌为人和动物肠道中的常居菌，一般多不致病，在一定条件下可引起肠道外感染。
• 某些血清型菌株的致病性强，引起腹泻，与人类疾病有关的大肠杆菌，统称为致泻性致泻性大肠杆菌大肠杆菌（enterovirulent E. coli ）•肠毒素性大肠杆菌（肠毒素性大肠杆菌（ETEC））• 致病性大肠杆菌（致病性大肠杆菌（EPEC））• 出血性大肠杆菌（出血性大肠杆菌（EHEC））• 侵袭性大肠杆菌（侵袭性大肠杆菌（EIEC）） •（（1）肠产毒性大肠杆菌（）肠产毒性大肠杆菌（Enterotoxigenic E. coli,ETEC））：引起婴幼儿和旅游者腹泻，出现轻度水泻，也可呈严重的霍乱样症状腹泻常为自限性，一般2～3天即愈营养不良者可达数周，也可反复发作致病因素是LT或ST，或两者同时致病有些菌株具有定居因子，常见者为O6：K15：H16、O25：K7：H42鉴定ETEC主要测定大肠杆菌肠毒素，血清型有一定参考意义 •（（2）肠致病性大肠杆菌（）肠致病性大肠杆菌（Enteropathogenic E.coli,EPEC））:是婴儿腹泻的主要病原菌，有高度传染性，严重者可致死；成人少见细菌侵入肠道后，主要在十二指肠、空肠和回肠上段大量繁殖切片标本中可见细菌粘附于绒毛，导致刷状缘破坏、绒毛萎缩、上皮细胞排列紊乱和功能受损，造成严重腹泻。
EPEC不产生LT或ST有人报道，EPEC可产生一种由噬菌体编码的肠毒素，因对Vero细胞（绿猴肾传代细胞）有毒性，故称VT毒素VT毒素的结构、作用与志贺氏毒素相似，具有神经毒素、细胞毒素和肠毒素性鉴定EPEC可根据临床表现与血清型 •(3)肠侵袭性大肠杆菌（肠侵袭性大肠杆菌（Enteroinvasive E.coli,EIEC））:EIEC的多数菌株无动力，生化反应和抗原结构均近似痢疾杆菌，应予注意•（（4）肠出血性大肠杆菌）肠出血性大肠杆菌（（Enterohemorrhagic E.coli,EHEC））:引起散发性或暴发性出血性结肠炎，可产生志贺氏毒素样细胞毒素EHCO的主要菌型是O157：H7，还可有O26、OⅢ等 •肠出血性大肠杆菌（EHEC）是能引起人的出血性腹泻和肠炎的一群大肠埃希氏菌以O157:H7血清型为代表菌株•生物学特征生物学特征 • EHEC O157:H7属于肠杆菌科埃希氏菌属革兰氏染色阴性，无芽胞，有鞭毛，动力试验呈阳性其鞭毛抗原可丢失，动力试验阴性 •EHEC O157:H7具有较强的耐酸性，pH2.5-3.0，37℃可耐受5小时；• 耐低温，能在冰箱内长期生存；在自然界的水中可存活数周至数月；• 不耐热，75℃ 1分钟即被灭活；对氯敏感，被1mg/L的余氯浓度杀灭。
• EHEC 的最适生长温度为33-42℃，37℃繁殖迅速，44-45℃生长不良，生长不良，45.5℃停止生停止生长长 •EHEC O157:H7除不发酵或迟缓发酵山梨醇外，其他常见的生化特征与大肠埃希氏菌 基本相似，但也有某些生化反应不完全一致，具有鉴别意义EHEC O157:H7虽然有uidA基因，但其编码的β-葡萄糖醛酸酶无活性，不能分解不能分解4-甲基伞形酮甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷葡萄糖醛酸苷（（MUG））产生荧光，即产生荧光，即MUG阴性阴性 •EHEC除其代表菌株O157:H7外，还包括O157:NM、O26:H11、O111:H8、O125:NM、O121:H19、O45:H2、O4:NM、O145:NM、O5:NM、O91:H21、O103:H2、O113:H2等血清型的部分菌株血清学鉴定包括O抗原和H抗原的鉴定前者可使用玻片凝集试验或胶乳凝集试验；后者则应先进行动力试验，动力活泼者再进行玻片和试管凝集试验 •EHEC O157:H7的另一个显著特征是可产生大量的Vero毒素（VT），也称作类志贺氏毒素（SLT），是EHEC的主要致病因子Vero毒素按免疫原性等方面的不同可分为VT1和VT2。
该毒素有一个A亚单位和5~6个B亚单位组成B亚单位与宿主肠壁细胞糖脂受体结合，具有毒素活性的A亚单位进入细胞，改变60s核糖体的组分，干扰蛋白质的合成编码VT的基因位于噬菌体上，可缺失而不产生VT •大肠杆菌的检验方法大肠杆菌的检验方法• •样品制备样品制备•LST和和EC初步筛选初步筛选•对每个样品,选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤,每管接种1mL将接种管置于36±1℃培养48±2h• 观察试管的产气情况：检查倒管内是否有气泡产生,用直径为3mm的接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5±0.5℃水浴箱内,培养48±2h •月桂基硫酸盐胰蛋白月桂基硫酸盐胰蛋白(月示月示)(LST)肉汤肉汤•胰蛋白胰蛋白(月示月示)或胰酪胨或胰酪胨(Trypticase) 20g•氯化钠 氯化钠 5.0g乳糖 乳糖 5.0g磷酸氢二钾磷酸氢二钾(K2HPO4) 2.75g磷酸二氢钾磷酸二氢钾(KH2PO4) 2.75g月桂基硫酸钠月桂基硫酸钠 0.1g蒸馏水蒸馏水 1000.0mL•倒立发酵管的倒立发酵管的20mm×150mm试管中试管中,每管每管10mL。
121℃高压灭菌高压灭菌15min最终最终pH6.8±0.2 •EC肉汤肉汤•胰蛋白胰蛋白(月示月示)或胰酪或胰酪(月示月示) 20.0g3号胆盐或混合胆盐 号胆盐或混合胆盐 1.5g乳糖 乳糖 5.0g磷酸氢二钾磷酸氢二钾(K2HPO4) 4.0g磷酸二氢钾磷酸二氢钾(KH2PO4) 1.5g•氯化钠 氯化钠 5.0g蒸馏水蒸馏水 1000.0mL•小发酵管小发酵管),每管每管8mL121℃高压灭菌高压灭菌15min,最终最终pH6.9±0.1 •EMB平板：平板：• 取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(EMB)平板,36±1℃培养24±2h• 检查平板上有无具黑色中心有光泽具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落或无光泽的典型菌落• 如有典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；如无典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落用接种针接触菌落中心部位,移种到营养琼脂斜面上,36±1℃培养18～24h • •生化试验：生化试验： 将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验 1 色氨酸肉汤 色氨酸肉汤：在36±1℃培养24±2h后,加Kovacs氏试剂0.2～0.3mL,上层出现红色为靛基质阳性反应 靛基质试验（靛基质试验（Indole））原理及照片原理及照片 • 2 MR-VP培养基：培养基：在36±1℃培养48±2h。
以无菌操作移取培养物1 mL至13mm×100mm试管中,加5％α-萘酚乙醇溶液0.6mL,40％氢氧化钾溶液0.2mL和少许肌酸结晶,振摇试管后静置2h,如出现伊红色,为VP试验阳性 将MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5 滴甲基红溶液如培养物变红色,为甲基红试验阳性,若变黄色则为阴性反应 •MR-VP试验原理及照片试验原理及照片•甲基红（甲基红（Methyl Red））试验试验• 肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红•V-P试验试验 某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应•大肠杆菌：MR + /VP - • •3 Koser氏枸椽酸盐肉汤：氏枸椽酸盐肉汤：于36±1℃培养96h记录有无生长•枸椽酸盐试验：•某些细菌能利用枸椽酸盐作为碳源，及磷酸铵作为氮源，将枸椽酸盐分解为二氧化碳，培养基反应后成碱性，由于指示剂的作用，培养基变为兰色•Koser氏枸椽酸盐肉汤氏枸椽酸盐肉汤 磷酸氢铵钠(NaNH4HPO4·4H2O) 1.5g 磷酸氢二钾(K2HPO4) 1.0g 硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.2g 枸椽酸钠(含2H2O) 3.0g 蒸馏水 1000.0mL 将各成分溶解于蒸馏水中,分装试管,每管10 mL,121℃高压灭菌15min。
最终pH6.7±0.2 • •4 LST肉汤：肉汤：于36±1℃培养48±2h,观察试管中是否产气 5 革兰氏染色革兰氏染色：取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色大肠杆菌为革兰氏阴性•结果报告：结果报告：• 大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌,发酵乳糖产酸产气,IMViC试验为＋＋－－或－＋－－,再根据LST肉汤阳性管数查MPN表,报告每克(毫升)样品中大肠杆菌MPN值 •致泻性大肠杆菌的检验（致泻性大肠杆菌的检验（GB方法简介）方法简介）•增菌增菌 以无菌手续称取检验25g，加在225mL营养肉汤中，以均质器打碎1min或用乳钵加灭菌砂磨碎取出适量，接种乳糖胆盐培养基，以测定大肠菌群MPN，其余的移入500mL广口瓶内，于36±1℃培养6h挑取1环，接种于1管30mL肠道菌增菌肉汤内，于42℃培养18h •分离分离 将乳糖发酵阳性的乳糖胆盐发酵管和增菌液分别划线接种麦康凯或伊红美蓝琼麦康凯或伊红美蓝琼脂平板脂平板；污染严重的检样，可将检样匀液直接划线接种麦康凯或伊红美蓝平板，于36±1℃培养18～24h，观察菌落不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也要注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落 •麦康凯琼脂平板麦康凯琼脂平板• •生化试验生化试验: 自鉴别平板上直接挑取数个菌落分别接种三糖铁琼脂(TSI)或克氏双糖铁琼脂(KI)。
同时将这些培养物分别接种蛋白胨水、半固体、pH7.2尿素琼脂、KCN肉汤和赖氨酸脱羧酶试验培养基以上培养物均在36℃培养过夜 TSI斜面产酸或不产酸，底层产酸，H2S阴性，KCN阴性和尿素阴性的培养物为大肠埃希氏菌TSI底层不产酸，或H2S、KCN、尿素有任一项为阳性的培养物，均非大肠埃希氏菌必要时做氧化酶试验和革兰氏染色 •三糖铁（三糖铁（TSI））琼脂试验的原理琼脂试验的原理•答案：答案：2－志贺氏菌 －志贺氏菌 3－沙门氏菌 －沙门氏菌 4－大肠杆菌－大肠杆菌 •尿素酶试验尿素酶试验•尿素酶试验在鉴别沙门氏菌的时候很重要 •血清学试验血清学试验 假定试验：挑取经生化试验证实为大肠埃希氏菌的琼脂培养物，用致病性大肠埃希氏菌、侵袭性大肠埃希氏菌和产肠毒素大肠埃希氏菌多价O血清和出血性大肠埃希氏菌O157血清做玻片凝集试验• 当与某一种多价O血清凝集时，再与该多价血清所包含的单价O血清做试验如与某一个单价O血清呈现强凝集反应，即为假定试验阳性 •证实试验：制备O抗原悬液，稀释至与Mac Farland3号比浊管相当的浓度原效价为1：160～1：320的O血清，用0.5%盐水稀释至1：40。
稀释血清与抗原悬液在10mm×75mm试管内等量混合，做单管凝集试验混匀后放于50℃水浴箱内，经16h后观察结果如出现凝集，可证实为该O抗原 •肠毒素试验肠毒素试验（产毒素性大肠杆菌）（LT－不耐热肠毒素，ST－耐热肠毒素） 1 酶联免疫吸附试验检测LT和ST 2 双向琼脂扩散试验检测LT 3 乳鼠罐胃试验检测ST•结果报告结果报告 综合以上生化试验、血清学试验、肠毒素试验作出报告 •大肠杆菌大肠杆菌 O157:H7的检验的检验•肠出血性大肠杆菌（EHEC）是能引起人的出血性腹泻和肠炎的一群大肠埃希氏菌以O157:H7血清型为代表菌株•EHEC O157:H7具有较强的耐酸性，pH2.5-3.0，37℃可耐受5小时；• 耐低温，能在冰箱内长期生存；在自然界的水中可存活数周至数月；• 不耐热，75℃ 1分钟即被灭活；对氯敏感，被1mg/L的余氯浓度杀灭• EHEC 的最适生长温度为33-42℃，37℃繁殖迅速，44-45℃生长不良，生长不良，45.5℃停止生长停止生长 •EHEC O157:H7除不发酵或迟缓发酵山梨醇外，其他常见的生化特征与大肠埃希氏菌 基本相似，但也有某些生化反应不完全一致，具有鉴别意义。
EHEC O157:H7虽然有uidA基因，但其编码的β-葡萄糖醛酸酶无活性，不能分解不能分解4-甲基伞形酮甲基伞形酮-β-D-葡萄糖葡萄糖醛酸苷（醛酸苷（MUG））产生荧光，即产生荧光，即MUG阴性阴性 •EHEC除其代表菌株O157:H7外，还包括O157:NM、O26:H11、O111:H8、O125:NM、O121:H19、O45:H2、O4:NM、O145:NM、O5:NM、O91:H21、O103:H2、O113:H2等血清型的部分菌株血清学鉴定包括O抗原和H抗原的鉴定前者可使用玻片凝集试验或胶乳凝集试验；后者则应先进行动力试验，动力活泼者再进行玻片和试管凝集试验 •EHEC O157:H7的另一个显著特征是可产生大量的Vero毒素（VT），也称作类志贺氏毒素（SLT），是EHEC的主要致病因子Vero毒素按免疫原性等方面的不同可分为VT1和VT2该毒素有一个A亚单位和5~6个B亚单位组成B亚单位与宿主肠壁细胞糖脂受体结合，具有毒素活性的A亚单位进入细胞，改变60s核糖体的组分，干扰蛋白质的合成编码VT的基因位于噬菌体上，可缺失而不产生VT •1、培养基制备：、培养基制备：• 改良EC新生霉素增菌肉汤 （mEC）： EC肉汤灭菌后添加20mg/mL过滤除菌的新生霉素，使终浓度为20μg/mL。
改良山梨醇麦康凯琼脂（TC-SMAC）：山梨醇麦康凯琼脂加入过滤除菌的1%亚碲酸钾溶液，使终浓度2.5mg/L，头孢克污，使终浓度为0.05mg/L MUG-LST肉汤：LST肉汤中添加4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG），使终浓度为0.1g/L •2、增菌培养、增菌培养• 秤取25克样品放入225mL mEC中，均质于41±1℃培养18-24小时•3、分离、分离• 将mEC肉汤培养物10倍递增稀释从10-4，10-5，10-6稀释度，各取0.1mL涂布于TC-SMAC平板于36±1℃培养18~24小时• 可疑 EHEC O157:H7菌落扁平，透明或半透明，边缘光滑，呈淡褐色中心，直径约2mm • •4、鉴定、鉴定• 挑取TC-SMAC上的可疑菌落，接种MUG-LST，于36±1℃培养18~24小时，出现产气，且出现产气，且无荧光无荧光者，分离到普通营养琼脂• 对纯菌落用EHEC O157:H7标准血清或胶乳凝集试剂作凝集试验，必要时进行生化试验• 在检测过程中，也可以在选择性增菌后，取出5mL增菌液，经100℃水浴15分钟灭活后，供自动酶联荧光免疫测试（VIDAS），迅速获得初步结果，阳性反应者需作进一步证实 •用上述方法在样品中分离获得的纯菌落，经抗E.coli O157:H7标准血清或EHEC O157:H7胶乳凝集测试为阳性者，报告检出肠出血性大肠杆菌O157:H7。
• 如需要进一步检测Vero毒素基因的存在，可通过接种Vero细胞或Hela细胞，观察细胞病变进行判定，或可使用基因探针检测和聚合酶链反应（PCR）检测法参见FDA细菌分析手册第8版）• • 。