单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,Chapter13,核酸的物理化学性质,一、核酸的水解,（一）核酸的酸水解或碱水解,核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断DNA,和,RNA,对酸或碱的耐受程度有很大差别例如，在,0.1 mol/L NaOH,溶液中，,RNA,几乎可以完全水解，生成,2,或,3,磷酸核苷；,DNA,在同样条件下则不受影响这种水解性能上的差别，与,RNA,核糖基上,2-OH,的邻基参与作用有很大的关系在,RNA,水解时，,2-OH,首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用形成水解产物DNA,一般对碱稳定，,RNA,对碱不稳定第,1,页,/,共,17,页,Chapter13 核酸的物理化学性质一、核酸的水解（,1,（二）核酸的酶水解,一、核酸的水解,生物体内存在多种核酸水解酶这些酶可以催化水解多聚核苷酸链中的磷酸二酯键以,DNA,为底物的,DNA,水解酶（,DNases,）和以,RNA,为底物的,RNA,水解酶（,RNases,）根据作用方式又分作两类：,核酸外切酶,和,核酸内切酶,核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端（,3,端或,5,端）开始，逐个水解切除核苷酸；核酸内切酶的作用方式刚好和外切酶相反，它从多聚核苷酸链中间开始，在某个位点切断磷酸二酯键。
在分子生物学研究中最有应用价值的是限制性核酸内切酶这种酶可以特异性的水解核酸中某些特定碱基顺序部位Chapter13,核酸的物理化学性质,第,2,页,/,共,17,页,（二）核酸的酶水解一、核酸的水解生物体内存在多种核酸水解酶2,Chapter13,核酸的物理化学性质,一、核酸的水解,（二）核酸的酶水解,脱氧核糖核酸酶类,1,、牛胰脱氧核糖核酸酶,(DNaseI),：从,5,磷酸末端切下寡聚核苷酸2,、,牛脾脱氧核糖核酸酶,(DNaseII),：从,5,磷酸末端切下寡聚核苷酸3,、限制性内切酶：存在于细菌体内，用于专一性地降解外源的,DNA,，限制性内切酶已成为基因工程最重要的工具酶如,EcoRI,（请看教材,503,504,页）,第,3,页,/,共,17,页,Chapter13 核酸的物理化学性质一、核酸的水解（,3,二、核酸的分子量、溶解性、粘度和酸碱性质,Chapter13,核酸的物理化学性质,1,、分子量在数百至数百万之间；微溶于水，不溶于有机溶剂；变性时粘度降低；,2,、核酸的碱基、核苷和核苷酸均能发生解离在一定的条件下可形成兼性离子，为两性电解质，具有等电点第,4,页,/,共,17,页,二、核酸的分子量、溶解性、粘度和酸碱性质Chapter13,4,Chapter13,核酸的物理化学性质,三、,核酸的紫外吸收,在核酸分子中，由于,嘌呤碱,和,嘧啶碱,具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，最大吸收峰波长（,max,）在,260nm,处,，可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。
第,5,页,/,共,17,页,Chapter13 核酸的物理化学性质三、核酸的紫外吸,5,Chapter13,核酸的物理化学性质,三、,核酸的紫外吸收,摩尔磷消光系数,508,页,增色效应：,核酸发生变性时，摩尔磷消光系数 增加的现象减色效应：,复性后，摩尔磷消光系数 又降低的效应第,6,页,/,共,17,页,Chapter13 核酸的物理化学性质三、核酸的紫外吸,6,Chapter13,核酸的物理化学性质,四、核酸,的变性、复性及分子杂交,(,一,),核酸的变性,(denaturation),核酸的变性,:,维系核酸三维结构的碱基堆积力和氢键如果受到某些理化因素的破坏，其三维结构就要改变，从而引起理化性质及生物学功能的改变，这种现象称为核酸的变性变性核酸将失去其部分或全部的生物活性核酸的变性并不涉及磷酸二酯键的断裂，所以它的一级结构,(,碱基顺序,),保持不变能够引起核酸变性的因素很多温度升高、酸碱度改变、甲醛和尿素等的存在均可引起核酸的变性变性与降解的区别：是否涉及共价键的断裂和分子量的改变第,7,页,/,共,17,页,Chapter13 核酸的物理化学性质四、核酸的变性、,7,第,8,页,/,共,17,页,第8页/共17页,8,Chapter13,核酸的物理化学性质,四、核酸,的变性、复性及分子杂交,核酸的变性的特征,DNA,的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。
因此，通常将引起,DNA,变性的温度称为融点，用,Tm,表示一般,DNA,的,Tm,值在,70-85,C,之间DNA,的,Tm,值与分子中的,G,和,C,的含量有关G,和,C,的含量高，,Tm,值高因而测定,Tm,值，可反映,DNA,分子中,G,C,含量，可通过经验公式计算：,（,G+C)%=(Tm-69.3)X2.44,影响,DNA,T,m,大小的因素：,DNA,的均一性；,GC,的含量；介质中的离子强度第,9,页,/,共,17,页,Chapter13 核酸的物理化学性质四、核酸的变性、,9,Chapter13,核酸的物理化学性质,四、核酸,的变性、复性及分子杂交,当,DNA,的稀盐溶液加热到,80-100,时，双螺旋结构即发生解体，两条链彼此分开，形成无规线团DNA,变性后，它的一系列性质也随之发生变化，如紫外吸收,(260 nm),值升高,粘度降低等第,10,页,/,共,17,页,Chapter13 核酸的物理化学性质四、核酸的变性、,10,Chapter13,核酸的物理化学性质,四、核酸,的变性、复性及分子杂交,(,二,),核酸的复性,(renaturation),核酸的复性,:,变性,DNA,在适当的条件下，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性。
DNA,复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复DNA,复性的程度、速率与复性过程的条件有关将热变性的,DNA,骤然冷却至低温时，,DNA,不可能复性但是将变性的,DNA,缓慢冷却时，可以复性分子量越大复性越难浓度越大，复性越容易此外，,DNA,的复性也与它本身的组成和结构有关第,11,页,/,共,17,页,Chapter13 核酸的物理化学性质四、核酸的变性、,11,(,二,),核酸的复性,(renaturation),第,12,页,/,共,17,页,(二)核酸的复性(renaturation)第12页/共1,12,Chapter13,核酸的物理化学性质,四、核酸,的变性、复性及分子杂交,(,三,),核酸的杂交,(hybridization),热变性的,DNA,单链，在复性时并不一定与同源,DNA,互补链形成双螺旋结构，它也可以与在某些区域有互补序列的异源,DNA,单链形成双螺旋结构，叫,核酸杂交,这样形成的新分子称为杂交,DNA,分子DNA,单链与互补的,RNA,链之间也可以发生杂交核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义Southern blotting,（,Southern,印迹法）：,DNA-DNA,杂交,Northern blotting,（,Northern,印迹法）：,DNA-RNA,杂交,Western blotting,（,Western,印迹法）：抗原,-,抗体结合,510,页,第,13,页,/,共,17,页,Chapter13 核酸的物理化学性质四、核酸的变性、,13,(,三,),核酸的杂交,第,14,页,/,共,17,页,(三)核酸的杂交第14页/共17页,14,五、核酸的沉降特性,Chapter13,核酸的物理化学性质,超速离心法纯化核酸。
分离,DNA,常用氯化铯密度梯度；分离,RNA,常用蔗糖密度梯度；应用啡啶嗅红,-,氯化铯密度梯度平衡超离心可将不同构象的,DNA,、,RNA,及蛋白质分开，是实验室最常用的纯化质粒,DNA,的方法,请看,515,页,第,15,页,/,共,17,页,五、核酸的沉降特性Chapter13 核酸的物理化学性,15,Chapter13,核酸的物理化学性质,六、核酸的凝胶电泳,1,、琼脂糖凝胶电泳：分析分子量大于,1000bp,的,DNA,片段,请看,516,页,2,、聚丙烯酰胺凝胶电泳：分析分子量小于,1000bp,的,DNA,片段,第,16,页,/,共,17,页,Chapter13 核酸的物理化学性质六、核酸的凝胶电,16,七、,DNA,的固相合成,520,页,八、,DNA,的限制酶图谱,限制性内切酶,来源于细菌，高度专一地识别外源,DNA,上的特定位点，并将其切断，形成形成粘性末端或平齐末端不降解自身细胞的,DNA,因为在自身相应位点上经甲基化修饰而受到保护DNA,的限制性内切酶图谱,何叫回文结构？,ATCGATC,GATCGAT,TAGCTAG,CTAGCTA,即对某,DNA,上所有的限制性酶切位点的确定。
本节完,第,17,页,/,共,17,页,七、DNA的固相合成 520页八、DNA的限制酶图,17,。