海带粗多糖的提取与鉴定实验报告3400字 海带多糖的提取和鉴定实验报告—0943713 王欢实验伙伴：0943623魏爽蛋白质、酶、核酸、多糖等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘的中心课题为了进行结构与功能的研究，首先必须解决制备问题，制备完毕要进行鉴定一、 实验目的1，掌握酶法提取海带硫酸多糖的原理和操作流程；2，了解多糖物质的常规纯化方法及原理；3，熟悉多糖含量测定的常用方法和原理；4，掌握硫酸－蒽酮法测定多糖的原理及操作流程、注意事项；二、实验原理本实验综合利用细胞匀浆和纤维素酶水解，破碎海带细胞壁，释放细胞内容物，包括多糖、海藻酸以及蛋白、核酸等；随后通过海藻酸与Ca2+的结合沉淀形成不溶性海藻酸钙，以去除其中的海藻酸；继而通过CTAB与多糖络合后溶解度下降的特性，将多糖与其他成份分离；最后在盐溶液中回溶多糖，并通过乙醇沉淀法获得多糖沉淀，即为海带粗多糖可采用硫酸－蒽酮法测定多糖的含量三、实验材料及试剂实验材料：干海带实验试剂：纤维素酶、1mol/L氯化钙溶液、硫酸、蒽酮、 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、 葡萄糖、 DE-23、DE-41、Sepharose(2B 4B 6B)等 仪器：组织匀浆机、水浴锅、台式高速离心机、分光光度计等(下面是一些仪器和设备的照片)四、实验步骤海带多糖的提取1．干海带加水浸泡过夜，充分溶胀后，加入1/3体积的水，放入组织匀浆机中，粉碎成海带浆。
取约100ml海带浆，调PH值为4.5-5.0，加入0.3g纤维素酶，于50度温浴水解4-6小时，间或搅拌，促进细胞壁水解这个过程我们的指导老师已经提前做好）2..在海带浆中加入50ml水，搅拌均匀，沸水浴5min，使纤维素酶失活，冷至室温，用6层纱布过滤，收集滤液（注：1、这个时候一定不要混入海带渣，防止对后面测量结果的影响， 2、过滤过程中可戴手套挤纱布，但是不要太用力使海带渣意外流出）(下面是过滤现场照片)3．向滤液中加入1/4体积1mol/L氯化钙溶液，搅拌均匀后，4层纱布过滤，去除海藻酸钙这个时候过滤比较简单，因为海藻酸钙是絮状沉淀，易过滤）(下面是过滤现场照片)4．于滤液中加入1/5体积的2%CTAB与海带多糖结合沉淀，12000rpm离心5min收集CTAB-多糖沉淀物1.要经过离心的两个管一定要配平，平行操作2.两个管相对放置3.离心参数设置4.记忆)（这是沉淀过程现象）5．在CTAB-多糖络合沉淀物中加入0.5ml 2mol/L氯化钾溶液，通过盐解作用，溶解释放海带多糖，然后加入2倍体积无水乙醇沉淀多糖，12000rpm离心5min硫酸-蒽酮法测定海带多糖含量1． 配制硫酸-蒽酮试剂:取2g蒽酮溶解于1000ml浓H2SO4中，当日配制使用。
硫酸-蒽酮试剂对人体有很大的腐蚀性，这个操作是由几个学姐完成的） .2．绘制葡萄糖标准曲线:准确量取100μg/ml葡萄糖标准溶液0，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00ml，注入糖管中，补充纯水至1.00ml（下表）并分别加入4.00ml硫酸-蒽酮试剂，盖塞后立即摇匀，迅速浸入冷水浴中，各管加完后一起置于沸水浴中10min，，封口防蒸发，取出流水冷却，室温放置10分钟，于620nm处比色，测定吸光度值以测得的吸光度为纵坐标，标准葡萄糖含量为横坐标，作出标准曲线葡萄糖溶液接触硫酸-蒽酮试剂后立即放大量热，注意安全）（测吸光度的时候要先将两个比色皿配平，减少误差）（沸水浴之前）（沸水浴之后）3．海带多糖含量测定:将海带粗多糖以适量水溶解（约为10-80ug/ml），并准确量取1.00ml待测溶液，加入4ml硫酸-蒽酮试剂，同标准曲线之操作，比色测定根据标准曲线计算糖含量0.2ml—2ml（10倍）0.2ml—2ml（10倍）↓1ml—2ml（20倍）↓1ml—2ml（40倍）（这一步骤是在指导老师的指导下完成的，既不浪费样品又准确专业，因为一般生物方面的实验样品都比较少，必须注意节省用量，取总样品中的一部分即可，而且可以减少误差）实验数据五、注意事项：1. 海带细胞壁以纤维素为主，因此可用纤维素酶水解细胞壁破碎细胞，酶解作用温和，对于细胞内容物成分影响较小。
2. 在海带多糖的提取过程中，海藻酸类物质是主要的杂质成分，本实验通过加入Ca2+与海藻酸结合成为不溶性的海藻酸钙沉淀，去除海藻酸，初步纯化多糖3. CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子表面活性剂，在低离子强度的溶液中具有沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，而在高离子强度的溶液里，CTAB又可与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多糖形成复合物因此，本实验利用了CTAB沉淀多糖的性质，将多糖与其他成份分离，且这种酸性多糖沉淀物可在一定盐浓度下被重新溶解而不引起其他性质的改变，可用于多糖的纯化4. 多糖中常含有大量羟基，极性较大，在水溶液中溶解性很好，而在低极性的有机溶剂（如乙醇）中溶解度较小，因此，向多糖溶液中加入乙醇，可降低水溶液的介电常数，使多糖脱水从而产生沉淀来浓缩多糖六．问题讨论1. 谈谈海带硫酸多糖有哪些生物学功能及其开发前景海带硫酸多糖Laminaria polysaccharide sulfate，是存在于褐藻植物体细胞间的多糖物质，主要成分是α-L-岩藻糖4-硫酸酯的多聚物，同时还含有不同比例的半乳糖、甘露糖、木糖和葡萄糖醛酸，已被证明具有抗肿瘤、抗病毒、降血糖血脂作用,免疫调节作用，及调节细胞增殖作用，还有清除活性氧自由基作用和体内外抗氧化作用等。
等多种生物学功能，是潜在的海洋药物来源 但是从海带中提取的海带硫酸多糖其分子量大都在几十万甚至上百万，分子量较大，免疫原性强，给理化性质分析及生物学功能研究带来了困难，而且海带硫酸多糖具有很强的复杂性及不均一性，这决定了分子量不同的海带硫酸多糖的生理活性是不同的多项研究表明小分子海藻硫酸多糖的生理活性比大分子硫酸多糖更加显著海带硫酸多糖的降解可分为酸解法、碱解法、酶解法、盐解法、氧化降解以及超声波、γ-射线、自由基降解法．自由基降解海带硫酸多糖是一种可行的可用于大量制备低分子量多糖的新技术．降解之后的海带硫酸多糖有广泛的生物学功能，具有巨大的开发前景，这种方法也可用于其它多糖的降解．2. 除硫酸-蒽酮法以外，还有哪些方法可用于多糖的定量，并简述其原理用于多糖的定性与定量分析方法有很多，我查阅到的有以下几种：1.多糖的酶解及验证：多糖水溶液以比色法测定含量；2..经ＨＰＳＥＣ－ＥＬＳＤ分析，比较酶解前、后多糖图谱的变化；3.多糖酶解液中糖类成分直接ＨＰＬＣ分析或柱前衍生化后ＨＰＬＣ分析；以标准单糖、糖醛酸、双糖等为对照和以色谱峰质荷比为参比，进行糖谱色谱峰识别；其稳定的特征片段，则用作定量分析指标；4.通过上述各步骤的独立或联合应用，构建基于结构信息的多糖酶解响应特征和多糖酶解糖谱，实现对多糖的定性、定量分析。
七．心得体会通过本次开放性试验我学到了很多有用的东西，是我在平常课堂甚至实验中从未思考过的，以前只知道实验前预习一下看看课本，做实验时认真听老师讲授，做的时候按照书上的步骤做，试验后写完实验报告就可以了，从未考虑过本次试验的实验思路以后我们自己设计实验的时候最先需要的就是实验思路，大学低年级时期的实验正是让我们通过做别人设计的实验学会思考实验，设计实验每次做实验之前都要想清楚实验的整体思路，不要做一步看书一步，这样只是盲目的做而没有真正掌握，以后记忆也不深刻，无益于科学研究其次，做每一次试验都要做到实事求是，不怕繁琐，我们本次实验小组的两位学姐由于一个数据出了问题马上决定重做，毫不怕麻烦，值得学习还有，由于我以前做过紫外分光光度计的使用，而本次试验时却又忘记了，说明以前掌握的不扎实，因为只是简单的完成书上的任务，没有真正掌握最后，本次试验要非常感谢指导老师的耐心指导教授还有我与同伴的合作非常愉快，很有默契，顺利完成实验，可见团队精神的重要性，做科研工作肯定需要与别人合作，要互相配合，互相帮助第二篇：质粒的提取酶切 实验报告 1500字实验一 质粒的提取酶切实验目的掌握质粒小量快速提取法。
用琼脂糖凝胶电泳法鉴定其纯度 实验原理质粒是一种染色体外的稳定遗传因子大小在1~200kb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息他可独立游离在细胞质内，也可整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能却赋予宿主细胞的某些表型采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）可使细胞壁裂解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中用酒精沉淀洗涤，可得到质粒DNA在细胞内，共价闭环DNA（cccDNA）常以超螺旋形式存在若两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫作开环DNA（ocDNA）在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度都快，因此在本实验中，质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带限制性内切酶是一种工具酶，这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA的双链，形成一定长度和顺序DNA片段。
EcoR I和Bgl II的识别序列和切口是： EcoR I：G↓AATTCBgl II: A↓GATCTG，A等核苷酸表示酶的识别序列，箭头表示酶切口限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少酶切片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别用已知分子量的线状DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，就可以粗略推测分子形状相同的未知DNA的分子量实验步骤（一）质粒的提取1.培养细菌 将带有质粒DH5ɑ的大肠杆菌接种于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的1×LB中，37℃培养过夜2.取液体培养菌液1.5ml置塑料离心管中，10 000r/min离心lmin，去掉上清液加入150μl溶液I，充分混匀，在室温下放置10min3.加入200μl新配制的溶液II，加盖后温和颠倒5~10次，使之混匀，冰上放置2min4.加入150μl冰冷的溶液III，加盖后温和颠倒5~10次，使之混匀，冰上放置10min5.用台式高速离心机，10 000r/min离心5min，将上清液移入干净的离心管中6.向上清液中加入等体积酚/氯仿（1：1，v/v），振荡混匀，转速10 000r/min，离心2min，将上清液转移至新的离心管中。
7.向上清液加5mol/LNaCl至终浓度为0.3mol/L，混匀，再加入2倍体积无水乙醇，混匀，室温放置2min，离心5min，倒去上清乙醇溶液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体8.加0.5ml 70%乙醇，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥9.加入50μl含RNase A 20μg/ml的TE缓冲液溶解提取物，室温放置30min以上，使DNA充分溶解待用或置-20℃备用（也可用试剂盒按操作步骤提取质粒）10.将抽提出来的质粒进行琼脂糖凝胶电泳（二）质粒的酶切和鉴定质粒DNA酶切的加样重组质粒 5μL10× buffer 1μLBgl II 1μLEcoR I 1μLddH2。