目录生物化学与分子生物学生物化学与分子生物学目录DNA重组和重组DNA技术DNA Recombination and Recombinant DNA technology第二十一章张金玉DNA重组和重组DNA技术DNA Recombination and Recombinant DNA technology第二十一章张金玉DNA重组和重组DNA技术DNA Recombination and Recombinant DNA technology第二十一章目录nDNA重组（DNA recombination）是指不同DNA分子断裂和连接而产生DNA片段的交换并重新组合形成新DNA分子的过程n重组DNA技术（recombinant DNA technology）是指在体外将两个或两个以上DNA分子重新组合并在适当细胞中增殖形成新DNA分子的过程 目录第一节自然界DNA重组和基因转移DNA Recombination and Gene Transfer in Nature目录DNA重组同源重组 (homologous recombination)位点特异性重组(site-specific recombination)转座重组(transposition recombination)接合作用 (conjugation)转化作用 (transformation)转导作用 (transduction)目录Ø 发生在同源序列间的重组称为同源重组 (homologous recombination)，又称基本重组 （general recombination）。
是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在 两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片 段的交换 Ø 以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制 的Holliday模型一、同源重组是最基本的DNA重组方式目录nHolliday模型的4个关键步骤： Ø两个同源染色体DNA排列整齐；片段重组体(patch recombinant)拼接重组体(splice recombinant) Ø 一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA 对应的链连接，形成Holliday中间体；Ø 通过分支移动产生异源双链DNA；Ø Holliday中间体切开并修复，形成两个双链 重组体DNA，分别为：目录Ø 片段重组体 （见模型图右边产物）： 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组 体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNAØ 拼接重组体（见模型图左边产物）：切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA 目录n参与细菌DNA同源重组的酶有数十种，其中最 关键的是RecA蛋白、RecBCD复合物和RuvC蛋 白nRecBCD复合物具有三种酶活性，即依赖于ATP 的核酸外切酶活性、可被ATP增强的核酸内切 酶活性以及需要ATP的解螺旋酶活性。
nRecA蛋白可结合单链DNA（ssDNA），形成 RecA-ssDNA复合物 nRuvC有内切酶活性，能专一性识别Holliday连 接点，并有选择地切开同源重组体的中间体 内切酶(recBCD) DNA侵扰 (recA)分支迁移(recA)内切酶 (recBCD)DNA连接酶5´3´5´ 3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´ 5´3´5´3´5´3´5´3´ 5´3´5´ 3´5´3´3´3´5´3´ 5´3´3´5´5´3´5´3´5´3´Holliday中间体5´3´5´3´5´3´ 5´3´Holliday中间体5´3´5´3´5´3´ 5´3´5´5´ 3´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´ 5´3´3´3´5´5´5´ 5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´内切酶 (ruvC)内切酶 (ruvC)DNA 连接酶DNA 连接酶拼接重组体片段重组体目录二、位点特异重组是发生在特异位点 间的DNA整合Ø 位点特异性重组(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。
目录λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒cDNA的长末端重复序列(long terminal repeat, LTR) （一）λ噬菌体DNA的整合目录（二）细菌的位点特异性重组沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变目录Øhix为反向重复序列，它们之间的H片段可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)H片段上有两个启动子P，其一驱动hin基因表达，另一正向时驱动H2和rH1基因表达，反向(倒位)时H2和rH1不表达rH1为H1的阻遏蛋白基因目录H2鞭毛素阻遏蛋白Hin重组酶转位片段hinH2IH1H1鞭毛素hinH2IDNA启动序列H1启动序列沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变目录（三）免疫球蛋白基因的重排（了解）Ø 免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(L链)和两条重链(H链)组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链(和)，一个编码重链 轻链的基因片段：重链的基因片段：L V J C L V D J C 目录Ø 重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基 因的V-J重排均发生在特异位点上。
在V片 段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧 均存在保守的重组信号序列(recombination signal sequence, RSS)此重排的重组酶基 因rag (recombination activating gene)共有 两个，分别产生蛋白质RAG1和RAG2 CACAGTG(12/23)ACAAAAACC GTGTCCAC TGTTTTTGG重组信号序列基因片段目录免疫球蛋白基因重排过程目录三、转座重组可使基因移位Ø 由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座(transposition)Ø 大多数基因在基因组内的位置是固定的，但有些基因可以从一个位置移动到另一位置这些可移动的DNA序列包括插入序列和转座子 目录Ø 插入序列(insertion sequences, IS)组成：IRTransposase GeneIR（一）插入序列转座• 二个分离的反向重复(inverted repeats, IR)序列• 特有的正向重复序列• 一个转座酶（transposase)编码基因目录Ø 插入序列发生转座的形式：保守性转座(conservative transposition) 复制性转座(duplicative transposition)目录插入序列的复制性转座目录Ø 转座子(transposons) ——可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。
IRIRTransposase Gene有用基因（二）转座子转座Ø 转座子组成： 反向重复序列转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因目录细菌的可流动性元件A 插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列(箭头所示)B 转座子Tn3：含有转座酶、β-内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因C 转座子Tn10：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列IS10L目录由转座子介导的转座目录四、原核细胞可通过接合、转化和转导 进行基因转移或重组（一）接合作用当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用(conjugation)目录Ø 可接合质粒如 F 因子(F factor) 细菌染色体外的小型环状双链DNA分子Ø 质粒目录（二）转化作用通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用 (transformation)目录例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取目录（三）转导作用当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用(transduction)。
目录λ噬菌体的生活史溶菌生长途径 (lysis pathway)溶源菌生长途径 (lysogenic pathway)目录第二节 重组DNA技术Recombinant DNA Technology目录重组DNA技术的发展史1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉目录重组DNA技术相关概念Ø 克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷 贝的集合Ø 获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)， 即无性繁殖DNA克隆目录Ø 技术水平：分子克隆(molecular clone)（即DNA 克隆） 细胞克隆个体克隆（动物或植物） 目录其主要过程包括：在体外将目的DNA片段 与能自主复制的遗传元件（又叫载体）连接， 形成重组DNA分子，进而在受体细胞中复制、 扩增，从而获得单一DNA分子的大量拷贝。
Ø重组DNA技术，又称分子克隆（molecular cloning）或DNA克隆（DNA cloning）或基因工程（genetic engineering）技术目录Ø 目的：① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）目录一、重组DNA技术中常用的工具酶Ø 限制性核酸内切酶Ø DNA聚合酶ⅠØ 逆转录酶Ø T4DNA连接酶Ø 碱性磷酸酶Ø 末端转移酶Ø Taq DNA聚合酶重组DNA技术中常用的工具酶工 具 酶功 能 限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二 酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ①合成双链cDNA分子或片段连接；②缺口平移制作高比 活探针；③ DNA序列分析；④填补3末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53 聚合、35外切活性，而无53外切活性常用于 cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标记等反转录酶①合成cDNA；②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或 DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基目录限制性核酸内切酶(restriction endonuclease) 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是一类核酸内切酶，能识别双链DNA分子内部的特异序列，并裂解磷酸二酯键。
GGATCC CCTAGGG CCTAGGATCCG++Bam HⅠØ 定义：目录与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNAⅠ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）Ø 分类：Ø 作用：目录第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序Ø 命名：Hin dⅢ属 系 株 序Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶目录Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) 切口 ：平端切口、粘端。