金黄色葡萄球菌定性检验 1 了解金黄色葡萄球菌生物学特性 2 掌握金黄色葡萄球菌定性检测程序和检验方法 学习目的与要求 大多数菌株产生类胡萝卜素 使细胞团呈现出深橙色到浅黄色 色素的产生取决于生长的条件 故称金黄色葡萄球菌 高盐甘露醇平板 金黄色葡萄球菌为淡黄色菌落 其他葡萄球菌为白色菌落 最适生长温度37 最适pH为7 4 兼性厌氧菌 在好氧条件下生长最好 可在高盐环境下生长 15 氯化钠环境下还能生长 一般用含10 氯化钠的胰酪胨大豆肉汤增菌或7 5 氯化钠肉汤增菌 所有的毒株产生血浆凝固酶 人和动物来源的菌株通常可凝固兔 人 马和猪的血浆 金黄色葡萄球菌产生磷脂酶 蛋白酶 脂肪酶和溶菌酶等 大多数菌株可水解天然的动物蛋白并释放脂肪酸 在BP平板产生磷脂环 生物学特性 致病性 金黄色葡萄球菌为条件致病菌 菌株致病力的强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶 a 溶血素 外毒素 能损伤血小板 破坏溶酶体 引起肌体局部缺血和坏死 在血平板培养出现溶血环 b 杀白细胞素 可破坏人的白细胞和巨噬细胞 c 血浆凝固酶 当金黄色葡萄球菌侵入人体时 该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固 阻碍吞噬细胞的吞噬作用 d 耐热核酸酶e 肠毒素 引起急性胃肠炎 葡萄球菌性食物中毒是葡萄球菌肠毒素所引起的疾病 可引发不同程度的急性胃肠炎症状 恶心 呕吐最为突出而且普遍 腹痛 腹泻次之 当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品 如牛奶和奶制品 肉 蛋等 在温度条件适宜时 经8 10小时即可相当数量的肠毒素 二 检验程序与操作方法 食品安全国家标准GB4789 10 2016食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验第一法金黄色葡萄球菌定性检验 检样25g ml 样品 225ml7 5 氯化钠肉汤 均质 检样25g ml 样品 225ml7 5 氯化钠肉汤 均质 检样25g ml 样品 225ml7 5 氯化钠肉汤 均质 检样25g ml 样品 225ml7 5 氯化钠肉汤 均质 检样25g ml 样品 225ml7 5 氯化钠肉汤 均质 检验程序 样品处理 称取25g mL 样品至盛有225mL7 5 氯化钠肉汤的无菌均质杯内 8000r min 10000r min均质1min 2min 或放入盛有225mL7 5 氯化钠肉汤无菌均质袋中 用拍击式均质器拍打1min 2min 检验程序 增菌 利用金黄色葡萄球菌耐盐的特性 最高可耐受15 的氯化钠 用7 5 氯化钠肉汤增菌 36 1 培养18h 24h 检验程序 分离培养 血平板和BP平板 血平板 金黄色葡萄球菌可以产生溶血素 因此在血平板上产生明显的溶血环 典型菌落 呈金黄色 有时也为白色 大而突起 圆形 不透明 表面光滑 菌落周围有完全透明溶血环 大而突起 圆形 不透明 表面光滑 有溶血环 阳性 阴性 BP 贝尔德 帕克 平板 胰蛋白胨 牛肉膏和酵母膏提供碳源 氮源 硫 维生素和矿物元素丙酮酸钠是一种生长促进剂亚碲酸盐对除金黄色葡萄球菌外的其他能分解卵黄的菌株有毒性 并使菌落产生黑色卵黄提供营养和有利于观察卵磷脂环甘氨酸和氯化锂对金黄色葡萄球菌以外的其它菌株有抑制作用 检验程序 分离培养 在BP平板上典型菌落为 圆形 表面光滑 凸起 湿润 菌落直径为2mm 3mm 颜色呈灰黑色至黑色 有光泽 常有浅色 非白色 的边缘 周围绕以不透明圈 沉淀 其外常有一清晰带 当用接种针触及菌落时具有黄油样黏稠感 有时可见到不分解脂肪的菌株 除没有不透明圈和清晰带外 其他外观基本相同 从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落 其黑色常较典型菌落浅些 且外观可能较粗糙 质地较干燥 B P平板 圆形 光滑 黑色有光泽 周围绕以不透明圈 其外有清晰带 革兰氏阳性 球形 葡萄状 无芽孢 无荚膜 检验程序 确证鉴定1 革兰氏染色镜检 检验程序 确证鉴定2 血浆凝固酶试验 金黄色葡萄球菌可以产生血浆凝固酶 因此对其鉴别的主要试验是测定其凝固酶 试管法挑取BP平板或血平板上至少5个可疑菌落 少于5个全选 分别接种于BHI肉汤和营养琼脂小斜面 36 1 培养18h 24h 取0 5mL无菌生理盐水加入瓶装冻干兔血浆中至完全溶解 加入培养后的BHI肉汤培养物0 2 0 3mL 振荡摇匀 放36 1 恒温箱或水浴内 每半小时观察一次 观察6h 如凝固体积大于原体积一半时 判定为阳性 如结果可疑 从营养琼脂小斜面挑去菌落到BHI肉汤 重复凝固酶试验 不凝固 少量 零散凝固 明显的块状凝固 巨大块凝固 完全凝固 倒置不流动 阴性 阳性 试管法 结果报告 在25g mL 样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌 即 检出 25g mL 或未检出 25g mL 小结 了解金黄色葡萄球菌的生物学特性 耐盐 能产毒素 凝固酶等 掌握检验流程知识点 增菌液 BP平板和血平板的典型菌落特征 凝固酶试验 新旧标准主要差异 增菌液统一改成了7 5 氯化钠肉汤这个标准主要是因为2008版本参照美国FDA的方法增加了10 胰胨大豆肉汤以来 发现该增菌液使用效果不好 目标菌生长差 修改Baird Parker平板的培养时间为24h 48h 原来是18h 24h或45h 48h 挑取Baird Parker平板或血平板上可疑菌落至少5个 2010版1个以上 。