实验一 过氧化氢酶K m的测定【原理】本实验测定红细胞中过氧化氢酶的米氏常数过氧化氢酶（CAT）催化下列反应：2H2O2过氧化氢曹2H2O+O2 tH2O2浓度可用KMnO4在硫酸存在下滴定测知2KMnO4+5H2O2+3H2SO4 ——> 2MnSO4+K2SO4+5O2 t+8H2O求出反应前后h2o2的浓度差即为反应速度作图求出过氧化氢酶的米氏常 数试剂】1. 0.05mol/L草酸钠标准液 将草酸钠（AR）于100〜105°C烘12h冷却后， 准确称取0.67g，用水溶解倒入100ml量瓶中，加入浓H2SO4 5ml，加蒸馏水至 刻度，充分混匀，此液可贮存数周2. 约0.02ml KMnO4储存液 称取KMnO4 3.4g，溶于1000ml蒸馏水中， 加热搅拌，待全部溶解后，用表面皿盖住，在低于沸点温度上加热数小时，冷后 放置过夜，玻璃丝过滤，棕色瓶内保存3. 0.004mol/L KMnO4应用液 取0.05mol/L草酸钠标准液20ml,于锥形瓶 中,加浓H2SO4 ml，于70C水浴中用KMnO4贮存液滴定至微红色，根据滴定结 果算出KMnO4贮存液的标准浓度，稀释成0.004mol/L，每次稀释都必须重新标 定储存液。
4.约 0.08mol/L H2O2 液取 20%H2O2 (AR) 40ml 于 1000.0ml 量瓶中，加蒸馏水至刻度，临用时用0.004mol/L KMnO4标定之，稀释至所需浓度5. 0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）操作步骤】l.血液稀释 吸取新鲜（或肝素抗凝）血液0.1ml，用蒸馏水稀释至10ml， 混匀取此稀释血液1.0ml，用磷酸盐缓冲液（pH7.0, 0.2mol/L）稀释至10ml，得 1：1000 稀释血液2. H2O2浓度的标定：取洁净锥形瓶两只，各加浓度约为0.08mol/L的H2O2 2.0ml和25%H2SO4 2.0ml,分别用0.004mol/L KMnO4滴定至微红色从滴定用 去KMnO4ml数，求出H2O2的mol浓度3•反应速度的测定：取干燥洁净50ml锥形瓶5只，编号，按下表操作加入物(ml)12345H2O2(约 0.08mol/L)0.501.001.502.002.50蒸馏水3.02.502.001.501.00将各瓶置37°C水浴预热5min,依次加入1： 1000稀释血液每瓶0.5ml,边加边摇，继续保温准5min,按顺序向各瓶加25%H2SO4 2.0ml，边加边摇，使酶促反应立即终止。
最后用0.004mol/L KMnO4滴定各瓶至微红色，记录KMnO4消耗量(ml)计算】1.反应瓶中H2O2浓度(mol/L)二 H2°2mo1 浓度 ％ 加入H2°2m 1 数二 H2°2mm°1 数式中： 4 为反应液量 4ml)2.反应速度的计算：以反应消耗的H2O2 mmol数表示反应速度=加入的 H2O2 mmol 数－剩余的 H2O2 mmol 数即：H2O2 mol浓度x加入的毫升数一KMnO40.004 mol/Lx消耗的KMnO4毫升数x 5/2(式中：5/2为KMnO4与H2O2反应中mol换算系数)3 •求Km值:下面引用一次实验结果为例，求过氧化氢酶的 Km 值，供计算参考己知KMnO4为0.004mo1/L，标定出H2O2浓度为0.08mol/L，列表计算如下:计算程序12345①加人h2o2数0.501.001.502.002.50②加人 H2O2mmol=①X0.080.040.080.120.160.20③底物浓度[S]=②三40.010.020.030.040.05④酶作用后，KMnO4滴定ml1.353.706.409.8013.20⑤剩余 H2O2mmol= ④x0.004x5/20.01350.0370.0640.0980.132⑥反应速度V=②一⑤0.02650.0430.0560.0620.068⑦[S]/V=③三⑥ 0.377 0.465 0.536 0.645 0.735按前述方法作图求得Km=0.032mol/L。
思考题】1. Km值的意义是什么？2•测酶Km值的实验中，需要特别注意哪些操作？。