小麦萌发前后淀粉酶活力的比较 小麦萌发前后淀粉酶活力的比拟及电泳法测定蛋白含量 一.试验目的1.驾驭利用光照造就箱造就小麦的方法； 2.了解酶的制备及活力测定的一般原理与方法；3.驾驭淀粉酶的活力测定技术，了解小麦萌发前后淀粉酶活力的改变； 4.稳固对731或732S型分光光度计和离心机的娴熟运用；5.敏捷运用3，5-二硝基水杨酸比色法测定样品中复原糖含量的原理和方法； 6.驾驭SDS-PAGE聚丙烯酰胺电泳法； 二.试验原理种子中的碳水化合物主要是以淀粉的形式存在淀粉酶是一种水解酶，它能使淀粉水解为麦芽糖，催化反响为：2〔C6H10O5〕+n H2O------n C12H22O11麦芽糖具有复原性，与3，5-二硝基水杨酸在供热的条件下生成棕色的3-氨基-5-硝基水杨酸在必须范围内，棕色物质颜色的深浅程度与复原糖的量成正比，因此可利用比色法测定复原糖的量休眠种子的淀粉酶活力很弱，种子吸胀萌发后，酶活力渐渐增加，并随着发芽天数的增长而增加三.试验步骤1.种子发芽小麦种子浸泡2.5h后，放入25℃恒温箱内发芽 2.酶液提取取发芽第三天或者第四天的幼苗8株，放入研钵中，参加石英砂少许，参加PH6.8磷酸盐缓冲液10ml，研磨至匀浆状。
在室温下静置20min，搅拌几次提取液1500rpm离心7min上清倒入量筒，测定酶提取液总体积，并将酶液稀释10倍 取枯燥种子或者浸泡2.5h后的种子8粒作为参照，步骤同上 3.SDS-PAGE聚丙烯酰胺电泳法测定蛋白条带 4.酶活力的测定〔1〕取大试管6支，遵照下表参加各试剂 〔1〕取大试管6支，遵照下表参加各试剂空白1酶液〔ml〕0.1%麦芽糖〔ml〕1%淀粉〔ml〕水〔ml〕10.5标准 萌发前230.50.51140.51 萌发后50.5160.51将各试管摇匀，放入37水浴锅中保温3min，马上向各试管中参加DNS试剂2ml 〔2〕取出各管，放入沸水浴中加热5min，流水冷却至室温，加水稀释至25mL，充分混匀后1:1稀释用空白管做参照，在520nm处测定各管OD值，并对3和4、5和6管分别取平均值作为萌发前和萌发后的OD值 四.计算 依据溶液的浓度与光汲取值成正比的关系，即 A标准/A未知=C标准/C未知 可推导出C酶液=A酶液/A标准×C标准 8粒的总活力=C酶×n酶×V酶 A为光汲取值；C酶=酶液管的麦芽糖浓度;n酶=酶液稀释倍数;V酶=提取酶液总体积。
五．蛋白质浓度测定--考马斯亮蓝G250染色法蛋白质定量测定溶液 0管 酶液〔萌发前〕 酶液〔萌发后〕 0.1 0.1 蛋白液/mL --0.9%生理盐水/mL 1.0 0.9 0.9 蛋白质染色液/mL 5.0 5.0 5.0 轻轻摇匀，5min后以0管调空白，595nm分光光度法测光密度值 六、试验结果〔1〕酶活力的测定 酶提取液总体积 酶液最终稀释后测定的小麦萌发前与萌发后的OD值 OD值 平均值 空白 1 标准 2 0.248 0.248 3 0.217 0.201 萌发前 4 0.185 5 0.612 0.641 萌发后 6 0.669 萌发前 9ml 萌发后 8ml n酶=10×〔25/0.5〕×2=1010 ，A标准=0.248，C标准=0.001%， 1、 萌发前：A酶液=0.201， V酶=9.0mlC酶液=A酶液/A标准×C标准=0.201/0.248×0.001% 8粒的总活力=C酶×n酶×V酶=0.07392、萌发后：A酶液=0.641， V酶,=8.0ml， C酶液=A酶液/A标准×C标准=0.641/0.248×0.001% 8粒的总活力=C酶×n酶×V酶=0.207〔2〕蛋白质浓度的测定 OD值 平均值 小麦萌发前： A蛋白质=0.113 由标准曲线，Y=0.0081X — 0.0515，R2=0.10142可知，x为20.3086，由于酶液被稀释了10倍，所以，蛋白质浓度为203.086μg/ ml。
小麦萌发后： A蛋白质=0.096由标准曲线，Y=0.0081X — 0.0515，R2=0.10142可知，x为 18.20101，由于酶液被稀释了10倍，所以，蛋白质浓度为182.0101μg/ ml1 0.104 0.113 萌发前 2 0.121 3 0.064 0.096 萌发后 4 0.128 七、探讨由试验数据结果可以看出小麦萌芽后淀粉酶的活力会比萌芽前明显增加，小麦种子在萌发过程中淀粉酶活力提升，淀粉被大量水解为小分子糖，那么就可以供应较多的能量供给萌发时候的细胞分裂以及细胞生长运用，同时还能够为细胞的生命活动供应原料，能够更快地将储存的有机物中的能量释放出来，保证萌发过程能量供给足够八、试验留意事项1、种子研磨应匀称，以助于酶液的提取2、在测定蛋白质浓度及酶液时，应快速测量，以防止反响试剂的分解，提高测定的正确性 3、试验过程中留意平安 本文来源：网络收集与整理，如有侵权，请联系作者删除，谢谢！第5页 共5页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页。