小鼠骨髓细胞染色体标本的制备/观察/核型分析,武汉大学生命科学学院,染色体技术的发展,1920年提出； 直到1956年，Albert Levan和华裔学者蒋有兴应用低渗处理、秋水仙素和植物凝激素，才使该技术得到了实质性的发展和完善； 20世纪70年代，出现了多种染色体显带技术，提高了染色体分析的精确度； 20世纪80年代中期，荧光原位杂交、显微切割及染色体涂染等新技术的出现，使染色体细胞水平的研究与分子水平的探索衔接起来染色体技术的应用及其意义,染色体技术应用领域：临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学、特殊细胞的标记、杂种细胞的鉴定等 染色体技术应用意义：(1)用于染色体组型分析；(2)物种的特征及种属亲缘关系；(3)分析物种的变异和进化过程；(4)识别单条染色体及基因定位；(5)染色体疾病研究、肿瘤学研究及产前诊断；(6)环境毒物、临床药物毒性检测染色体核型：指一个物种所特有的染色体数目和每一条染色体的形态特征人类体细胞中共有23对染色体，22对常染色体，一对性染色体 核型分析：将待测细胞的核型进行染色体数目、形态特征分析的过程称核型分析 核型模式图：是指将一个染色体组的全部染色体逐个按其特征绘制下来，再按长短、形态等特征排列起来的图像。
常用实验生物和人细胞DNA含量 与染色体数目,数目 （2n=？） 长度 （绝对长度、相对长度） 着丝粒位置 （M\SM\ST\T） 随体与次溢痕的数目、大小和位置 带型分析,,染色体的特征,染色体的形态类型,1.00～1.67 1.68～3.00 3.01～7.00 7.01～,∞,染色体观察及核型分析,,,染色体技术在临床医学方面的应用,,,(顺铂引起的小鼠染色体畸变),染色体技术在药理学及毒理学方面的应用,,,,,中国水韭属植物体细胞中期分裂相 A. 云贵水韭; B. 高寒水韭; C. 台湾水韭; D. 中华水韭,物种的特征及种属亲缘关系 分析物种的变异、进化过程,染色体标本材料来源及制备过程,植物细胞染色体制片技术(根尖、花粉母细胞等)前处理-酶解去壁-低渗-固定-解离-染色-压片 动物染色体制片技术(骨髓细胞、体外培养细胞等)取骨髓细胞(体外培养细胞)-低渗-固定-滴片-染色 人体染色体制片技术(体外培养组织细胞、外周血淋巴细胞、胸腹水细胞、胎儿绒毛标本、实体瘤标本、羊水细胞、及皮肤、肝、肾标本) 快速法：注射秋水仙素-低渗-固定-滴片-染色,一、目 的 要 求,1. 掌握小鼠骨髓细胞染色体标本的制备方法；2.掌握染色体分组特征, 对染色体核型进行分析;3.了解并制备小鼠染色体核型图。
二、实 验 原 理,染色体的形态结构在细胞增殖周期中是不断地运动变化的，一般在有丝分裂中期，染色体的形态最典型、最易辨认和区分因此，制备染色体标本获取的是中期细胞 用适量的秋水仙素溶液注入动物腹腔内，可以阻止分裂细胞纺锤丝的形成，从而积累大量处于分裂中期的细胞骨髓细胞是一种增殖细胞，利用上述原理，通过常规的制片方法，观察小鼠骨髓细胞的染色体三、染色体制备的实验材料、试剂和用具,实验材料：体重18~25g的小白鼠； 实验试剂：200µg/ml秋水仙素、生理盐水、0.075M KCl低渗液、Carnoy固定液（甲醇：冰乙酸=3：1）、pH6.8磷酸缓冲液、Giemsa原液； 实验用具：眼科剪、眼科镊、草纸、1 ml注射器、 10 ml注射器、10 ml刻度离心管、低速离心机、恒温水浴锅、温度计、酒精灯、吸管、载玻片、染色架、100 ml盐水瓶、定时钟、废液缸、显微镜四、实 验 步 骤,1. 取材前小鼠按2µg/gBW 腹腔注射200µg/ml秋水仙素作用2.5 小时2. 取材：用颈椎脱臼法处死小鼠，取出完整股骨并纱布擦净3. 收集细胞：剪去股骨两头，用生理盐水冲洗股骨髓于离心管中，反复数次，至骨髓发白，1500~2000r/min离心8 min，弃上清。
4. 低渗处理：将约7ml预热37ºC的低渗液加入离心管中，吸管混匀，再置于37ºC 恒温水浴锅中保温15min(中途用吸管混匀一次)5. 预固定：取出离心管，向管底加入1ml新配制的固定液(甲醇：冰乙酸=3：1)，混匀，平衡，800~1000 r/min离心10 min，弃上清 6. 固定：向沉淀物中加入新鲜固定液5ml，用吸管轻轻吹打均匀，室温静置15min，平衡后800~1000 r/min离心10 min，弃上清7. 再固定：方法同步骤6四、实 验 步 骤 (续),,8. 制备细胞悬液：弃上清，留下沉淀物，加固定液0.2~0.3ml，用吸管轻轻吹打均匀9. 滴片：取干净湿冷玻片，将其倾斜30º，取少许细胞悬液于玻片上一定距离2~3滴于载玻片上(不要重叠)，用口轻轻吹散，在酒精灯火焰过几下10. 染色：在玻片标本上滴加Giemsa染液(Giemsa原液：pH6.8磷酸缓冲液=1：9)并铺匀，染色15min，用细自来水缓缓冲去染液至干净，晾干四、实 验 步 骤 (续),11. 小鼠骨髓细胞染色体观察（1）小鼠骨髓细胞染色体计数：选择20个染色体形态较典型、分散较好的分裂相计数小鼠骨髓细胞的染色体数。
2）小鼠染色体形态的观察：小鼠的染色体呈“U”形，全部为端部着丝粒染色体可配成20对，分成4组，其中一对为性染色体X染色体大小在5~6号之间，Y染色体最小四、实 验 步 骤,小 鼠 骨 髓 细 胞 染 色 体 图,五、注 意 事 项,固定液和Giemsa染液须现配现用； 低渗时间应掌握准确(？)； 低渗后的细胞吹打时动作要轻，离心速度不能高于1000 r/min (？) 1.材料：染色体的中期分裂相照片2.软件：Image J(http://rsbweb.nih.gov/ij/),核型分析,,,,,,,,,,1、染色体的测量 测量长短臂的长度（Q、P）确定各对同源染色体选择其中一条，用软件测量着丝点到长臂端和短臂端的距离得到Q、P数据,分析方法与步骤,2、染色体的计算臂比：染色体长臂与短臂长度之比，即q/p,3、填写染色体信息表,4、 将染色体按照大小、形态依次排列（粘贴在纸上）排列规则：从长到短,。