Chapter 2 Enzymes of Gene Engeneering第一节 限制性内切核酸酶（Restriction Endonuclease）能专一性识别双链DNA上的特殊核苷酸序列 ，并使每条链的一个磷酸二酯键断开来源：细菌、霉菌和蓝藻功能：细胞内限制性修饰系统的一部分，可 以降解“入侵”的外源DNA限制性内切酶作为细 菌体内保护自身、避 免被噬菌体入侵的作 用机制一、限制性内切酶的命名和 种类1.命名： 生物的属名的第一个字母和 种名的第一、二个字母命名 ，菌株的代号的一个字母， 和罗马数字表示EcoR IEscherichi a属名Coli种类Ry13株系编号第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株名； 用罗马数字表示发现的先后次序2.限制性内切酶的种类：平端5′突出粘端3′突出粘端识别序列：在双链DNA分子能够识别的特殊核苷 酸序列;一般为4-8bp1）二重旋转对称识别序列（回文序列）3. 限制酶的特点1). 识别顺序和酶切位点①识别４-8个相连的核苷酸MboI NGATCN；AvaII GG(A/T)CC BamHI GGATCC：PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC；SfiI GGCC N N N N N GGCCCCGGN’N’N’N’N’CCGG Fok I 5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’ 外侧，产生５’-端突起２）富含ＧＣ３）对称性—双对称EcoRI 5’-G A A T T C-3’3’-C T T A A G-5’ ４）切点大多数在识别顺序之内，也有例外５）限制酶切后产生两个末端，末端结构是 ５’-Ｐ和３’-ＯＨ2). 末端种类１）３’-端突起，个数为２或４个核苷酸Pst I 5’-CTGCAG-3’ 5’-CTGCA G-3’3’-GACGTC-5’ 3’-G ACGTC-5’２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸 EcoRI 5’-GAATTC-3’ 5’-GOH PAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’ 3’-CTTAAP HOG-5’３） 平齐末端SmaI 5’-CCCGGG-3’ 5’-CCC GGG-3’3’-GGGCCC-5’ 3’-GGG CCC-5’４）非互补的粘性末端ａ）切点在识别顺序之外的，如：FokIFok I 5’-GGATG(Ｎ)9-3’ 5’-GGATG(N)93’-CCTAC(Ｎ)13-5’ 3’-CCTAC(N)13ｂ）能识别简并顺序的，如：AvaIAvaI 5’-CPyCGPuG-3’CCCGGG; C TCGGG; CCCGAG; CTCGAG ５）相容性末端 如：BamHI G GATCCBglII A GATCTMboI, Sau3AI N GATCN上述几种限制酶产生的DNA片段仍可相连，由此形成的重组 分子能被MboI和Sau3AI识别和酶切，但BamHI和BglII的识别机率 只有1/16。
BamHI + MboI A/C/G/T GATCT/C/G/A BamHI和BglII(AGATCT)两种酶产生的相容性末端，相连后不能为两种酶所识别和酶切BamHI + BglII A/G GATCT/C不同末端的连接特性: 除第4种末端不能进行不同DNA分 子或同种DNA分子不同切点产生的末端相连外，其余4种末端可以相互连接4.同尾酶 (Isocaudamer)] 有些来源不同的限制酶，识别及切割序列各不相同，但却能产 生出相同的粘性末端MunI：5` - C A A T T G - 3` 3` - G T T A A C - 5`EcoRI：5` - G A A T T C - 3` 3` - C T T A A G - 5`5` - C A A T T G - 3` 3` - G T T A A C - 5`5` - G A A T T C - 3` 3` - C T T A A G - 5`重新连接后的序列：5` - C A A T T C - 3` 3` - G T T A A G - 5`两种同裂酶切割形成的DNA片段经连接后所形成的重组序列， 能否被原来的限制酶所识别和切割？5. 异源同序酶（Isoschizomer，同裂酶）1. 定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制 酶2. 特点：1）识别相同顺序2）切割位点的异同KpnI GGTAC C Asp718 G GTACCSstI CCGC GG SacI CCGC GG 6.限制酶的星反应（Star activity）1. 特点: 限制酶识别序列特异性降低2. 发生星反应的限制酶和条件（见下页）3. 星反应的利用和避免表1 具有星反应的限制性内切酶与条件 限制酶 诱发星活性的条件a 识别序列 AvaI 1, 2, 4 BamHI 1 - 5, 8 G GATCN, G PuATCC BstI 2, 4 BsuI 2, 4, 6 EcoRI 1, 2, 4 - 6 N AATTN HaeⅢ 2, 4 HhaI 2, 4, 7 HindⅢ 6 HpaI 1, 2, 4 PstI 1, 2, 4, 7 PvuⅡ 2, 4 SalI 1, 2, 4, 7 ScaI 4 - 6, 8 SstⅡ 2, 4 XbaI 2, 4, 7 a.1：亚乙二醇(45%)；2:甘油(12%)；3：乙醇(12%)；4：高酶/DNA比(>25U/μg)；5：Mn++代替Mg++；6:pH8.5; 7:二甲基亚砜(8%); 8:无NaCl。
3.限制性内切酶作为基因工程常用工具酶的机制：3.定向克隆的机制：4.利用噬菌体克隆大片段DNA的机制：5.重组DNA片段的检测：1）抗药性筛选2）显色性筛选1. 底物DNA：DNA的纯度、分子构型、识别序列的侧面序列、位点 的偏爱和DNA甲基化有关系 2.限制性内切酶的用量：酶的活性单位：（U/μl） 3.反应体系：20 μlDNA： 3.0 μl（1.0 μg）10 X Buffer： 2.0 μlEnzyme： 0.5 μlddH2O： 14.5 μl二、限制性内切酶的反应体系4.双酶切法：DNA： 3.0 μl（1.0 μg）10 X Buffer： 2.0 μlEnzyme 1： 0.5 μlEnzyme 2： 0.5 μlddH2O： 14.0 μl5.双酶切注意事项： 1）两个酶通用缓冲液中的活力； 2）用量的控制；6. 具体操作时应注意事项：①整个操作应在0℃进行，即在冰浴中进行，而 且是在加入其它试剂之后，最后加入酶。
②当切割大量DNA时，通常采用延长反应时间， 减少酶的用量③当DNA需2种或以上酶切时，应用通用缓冲液 ，若没有通用缓冲液时，只有用1种酶切完后， 纯化酶切产物，再进行下一个酶切反应 限制酶在各种缓冲液中的相对活性 Double Digestion(双酶切反应) 时Universal Buffer(通用缓冲液)的使用表 7. 对酶切结果进行分析通过限制性酶切可以得到一定数量的DNA片断，DNA带负电荷，因此，当DNA分子被置于电场中时它们就会向阳极迁移这样就可以通过凝胶电泳对酶切DNA片段进行分离内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开 完全消化（Complete Digestion） 12 341234只有有限数量的酶切位点被切开 通过缩短保温时间、降低反应温度或减 少酶的用量可达到局部消化的目的局部消化 12 3414部分酶切（Part Digestion）第二节 DNA连接酶（ DNA Ligase ） 1967年，世界上数个实验室几乎同时发现该酶2.1 基本性质：能将两段DNA拼接起来的酶，催化DNA相邻的5‘磷酸基团和3’羟基末断之间形成磷酸二酯键，封闭DNA单链缺口。
2.2 T4 DNA连接酶的作用机制：① ATP+DNA ligase(E)→ E-AMP+PPi② E-AMP上的AMP转移到DNA的5’磷酸根上， 使其 活化，释放出酶③ 活化的5’磷酸根与相邻的3’羟基形成3’,5’-磷酸二酯 键，并释放出AMP 8.1.3 两种DNA 连接酶 比较 T4 DNA ligase E .coli DNA ligase 来源 T4 噬菌体 大肠杆菌 分子量 68 kD 75 kD 辅助因子 ATP NAD+底物 1) 双链DNA分子的粘、平端 1)同源互补粘端2) RNA-DNA杂合体、RNA链缺口 2)双链分子中的单链缺口3) 双链DNA分子中的单链缺口应用范围 广泛 . 效率高 窄修复双链DNA缺口处的磷酸二酯键修复与RNA结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键连接多个平头双链DNA分子：注意：DNA连接酶不能连接两条单链的DNA分子 或环化的单链DNA分子，被连接的必须是双螺 旋DNA分子的一部分。
2.3 DNA片段之间的连接2.3.1 具互补黏性末端片段之间的连接¡基本原理：用 DNA连接酶连 接具有互补粘 性末端DNA片 段2.4 具平末端DNA片段之间的连接基本原理：直接用T4DNA连接酶连接. 2.5 DNA片段末端修饰后进行连接1) DNA末端同聚物加尾后进行连接基本原理：利用末端脱氧核苷酸转移酶转移核苷酸的特殊功能在DNA的末端加尾2) 黏性末端修饰成互补粘端或平末端后进行连接基本原理： 采用两种方法①修平：用核酸酶切除双链DNA分子的突出核苷酸，修 平后用T4连接酶作平末端连接②补平：用Kleno。