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1、生物技术综合大实验原核系统表达的绿色荧光蛋白的纯化宋捷（） 纪成功 孔令浩 王玉康 王鹏程 董奉新（西北农林科技大学）摘要：绿色荧光蛋白（GFP）的提纯是一套十分成熟的蛋白质提纯系统，本教学实验使用原核的大肠杆菌系统，通过转化带有GFP基因的原核表达载体到BL21表达菌株中，通过氨苄抗性筛选，用阿拉伯糖诱导表达。通过硫酸铵盐析，疏水层析，阴离子交换柱层析，凝胶过滤层析，各级纯化用紫外显色和SDS凝胶电泳检测，终末纯化后纯度较高。本实验较为成功的提取提纯了GFP，并较好训练蛋白质提纯技术。关键词：GFP 蛋白提纯 疏水层析 离子交换层析 凝胶过滤层析1. 介绍：GFP最早是由下村修等人在1962
2、年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。分子质量约为27kd，有238各氨基酸基团，三维结构为 圆柱，圆柱两端由一些较短的 螺旋盖住，圆柱中央是几段 螺旋，生色团位于圆柱中央。该结构性质稳定。本实验通过该分子的较为稳定，疏水特性，易电离成阳离子，分子较小的体征，选择盐析，疏水层析，阴离子交换层析，凝胶过滤层析逐级提纯GFP。2. 材料和方法2.1. pGFP质粒克隆及提取质粒是已经构建完成的，GFP基因表达由易受阿拉伯糖诱导的启动子控制，及常表达的氨苄抗性。碱裂解法（试剂实验室自配）提取。取1ml菌液于1.5
3、ml离心管，1000rpm离心30s，弃上清加入100l提质粒溶液I，震荡混匀加入200l溶液II，温和混匀置至于冰上5min加入150l溶液III，混匀，置于冰上5min1000rpm离心3min，转移上清于另一新1.5ml离心管，加入900l无水乙醇，混匀，室温静置3min12000rpm离心5min，弃上清，待其干燥于30l TE中溶解，冰上暂存。2.2. 转化取1.5ml OD600 0.30.4 BL21，冰浴30min4000rpm离心10min，弃上清加入200l 0.1M CaCl2悬浮沉淀，冰浴15min4000rpm离心10min，弃上清加入200l 0.1M CaCl2悬
4、浮沉淀，备用。取1l质粒DNA加入制备好的感受态细胞，温和混匀，置于冰上30min42C水浴锅，热击45-60s冰浴10min加入900l LB培养基，37C，150rpm震荡培养30min涂板（LBp/ara），37C温育过夜。2.3. 筛选重组子及扩大培养将平板放置紫外灯下检测，标记，挑取绿色荧光单菌落，于5mlLB（amp）培养基中37C、150rpm震荡培养7小时吸取2ml菌液，置于200mlLB（amp/ara）培养基中，37C、150rpm振荡培养过夜。本组的平板并无可视菌落，所以挑去他组菌落2.4. 收菌破碎收集菌液200ml于250ml离心管，共4管，5000xg离心10min
5、，弃上清每管30ml溶解缓冲液（50mM Tris-HCl，1mmol/L EDTA）重悬沉淀，将4管合并为1管每管加入60l溶菌酶，混匀将离心管置于冰上，超声波破碎仪探头插入离心管，探头离底部约1cm且不触离心管壁900w，超声3s，静止3s，共8min，重复3次7500xg离心15min，在紫外灯下观察沉淀（留样）和上清（留样），取上清备用。2.5. 盐析取上清定容至80ml取10ml做预实验用溶解缓冲液稀释至100ml分装至10只试管，每管10ml称取不同浓度梯度(NH4)2SO4（见下表），室温静置15min各取1ml于1.5ml离心管，7500rpm离心15min在紫外灯下观察GFP
6、沉淀情况，可看出，第五管（(NH4)2SO4含量50%）时出现沉淀（杂蛋白），第八管（(NH4)2SO4含量80%）沉淀量最大（GFP）在剩余70ml上清中加入20.37g(NH4)2SO4（含量50%），室温静置30min7500rpm离心15min，取上清加入36.12 g(NH4)2SO4（含量80%），室温静置15min7500rpm离心15min，弃上清，-20C保存。(NH4)2SO4（%）10%20%30%40%50%60%70%80%90%100%(NH4)2SO4（g）0.701.061.642.262.913.614.365.166.037.062.6. 疏水层析配制 平衡
7、缓冲液：2mol/ml(NH4)2SO4/TE,PH8.0start buffer A：1.3mol/ml(NH4)2SO4/TE,PH8.0洗脱缓冲液B：10mM Tris，1mM EDTA，PH8.0 将沉淀好的GFP用10ml 平衡缓冲液溶解，9000rpm离心10min，移上清液至另一大离心管备用。连接仪器，蒸馏水洗柱，确保仪器运行正常填装柱材（Phenyl Sephadex CL 4B），用3倍体积（约120ml）的平衡缓冲液平衡柱子（转速29转/分）将含GFP的上清液上柱，3倍体积（约120ml）洗脱缓冲液洗脱（转速60转/分）紫外灯观察GFP运动情况，结合层析图谱，当GFP快要流
8、出时，收集收集下来的液体留样，剩下部分装入处理好的透析袋中，用离子交换层析的start buffer A（20mM Tris-HCl，pH7.0）透析过夜。2.7. 阴离子柱层析配制 start buffer A：20mM Tris-HCl，pH7.0 洗脱缓冲液B：20mM Tris-HCl，pH7.0（含1M NaCl）将疏水作用层析的透析袋用PEG10000浓缩start buffer A洗柱填装柱材（DEAE Sephadex A 50），用3倍体积（约120ml）的start buffer A平衡柱子（转速30转/分）将含GFP的浓缩液上柱，3倍体积（约120ml）start buf
9、fer A及洗脱缓冲液B梯度洗脱（转速60转/分）紫外灯观察GFP运动情况，结合层析图谱，当GFP快要流出时，收集收集下来的液体留样，剩下部分装入处理好的透析袋中，用凝胶过滤层析的缓冲液（20mM Tris-HCl，pH7.0）透析过夜。2.8. 凝胶过滤层析配制缓冲液：20mM Tris-HCl，pH7.0将离子交换层析的透析袋用PEG10000浓缩缓冲液洗柱填装柱材（Sephadex G-75），用3倍体积（约120ml）的缓冲平衡柱子将含GFP的浓缩液上柱，缓冲液洗脱紫外灯观察GFP运动情况，结合层析图谱，当GFP快要流出时，收集收集下来的液体留样，剩下部分装入处理好的透析袋中，用PEG
10、10000浓缩浓缩好的液体收集备用。2.9. SDS凝胶电泳检测3. 实验结果GFP用硫酸盐最佳沉淀点的选择收集硫酸铵浓度在50%80%的蛋白质沉淀。3.1. 3级层析图谱疏水层析图谱收集紫外荧光显色较亮的四管，对照图中区域大约如箭头所示（陡升由于调高了敏感度）离子交换柱层析收集紫外荧光显色较亮的3管，对照图中区域大约如箭头所示凝胶过滤层析图中所显示区域未收集，在所示时间外有一管带微弱荧光，收集。3.2. SDS-page电泳图3.3.自左向右箭头所指条带依次是1他组三级纯化产物 2 本组三级纯化微弱荧光样品 3 离子交换纯化产物， 4离子交换层析传出+wash ，5 Maker ，6 疏水层
11、析产物浓缩产物， 7 疏水层析产物 ，8 疏水层析wash， 9 细胞破碎后上清 ，10 细胞破碎液体（可靠性较高的1，2，3，9,10标示泳道，蓝色箭头位置推测为目标条带）4. 分析与讨论4.1. 本组的重组子平板次日早晨检查时并没有可视菌落出现，继续培养，到下午是可看到2到3个绿色的重组子群落，分析可能是1.转化后菌株过于脆弱2.可能氨苄涂抹过多3.涂布器使用时未控制好温度4.2. 在用硫酸盐沉淀的时候，我总是主张直接用最大浓度硫酸盐直接沉淀，应该是有问题的，GFP有明显的荧光信号，很容易在盐析粗提的时候去除溶解性相差较大的杂蛋白。4.3. 细胞破碎后收集的液体有十分明亮的荧光，GFP的疏
12、水性较强，可与柱材上疏水基团结合，在盐离子浓度降低时解离，疏水层析结果如图，推测前几个峰出现时洗掉了数个杂带，可惜SDS电泳时失误，并不能看出哪些条带被洗掉。在装自装柱时，由于我并不熟练，导致柱子上盖胶条不紧，以及忘记初始化自动收集装置（阀门就没开），使得在平衡柱子的时候不停漏液，耽误了进度，也浪费了柱子4.4. 离子交换柱有十分好的纯化效果，目的蛋白区域有极高的吸收峰，局部浓度可能过高，下次要减缓流速，因为无法测量当时离子浓度，并不能给蛋白解离离子浓度区域给出建议，从电泳图上看，第三道，目标蛋白十分清晰，在上方存在数个杂蛋白（5个？）4.5. 凝胶过滤层析时，出现了数个失误 1 改变柱子压力
13、位置 ，2 转速过大（压力过大），3柱子填充过多，吸出一部分重装填，导致凝胶分层（后期大量蛋白卡在分界面） 4 与组员没有商讨好实验方案，导致中途实验进程不顺利 ，5 出现下方爆管，凝胶及蛋白漏出，重装填后不能洗出。电泳图上出现大量抖峰，是管内出现气泡所致，原因可能如下1 从下方给予负压，且流速过大 2 下方的管口漏气（一侧缝隙我们添加了液体，并未漏泄，接口处可能漏液），3 凝胶的缝隙中本身有空气，4，buffer并未排气，在负压条件下溶解的空气被析出 4 压强过低出现真空泡由于出现了大量蛋白卡在分界面上，且前期从电泳图上看到分离出约两种杂蛋白，我们采取了倒出胶体重新装柱，重新洗脱的方法，所以
14、紫外吸收图谱并未记录。4.6. 凝胶电泳的分离胶是我配的，一块水封时候用力过大，出现了凹面，并未有多余，所以只好自用，对点样结果的的美观性有影响，组员点样的时候可能出现失误，使得5,6,7,8与位置不符合，可能未点上。从前三个泳道分析，小韦组结果十分好，目标条带及其明亮，可能我们组拿的并不是波峰管，所以上方有微弱杂带。我们的离子交换柱结果较好，凝胶柱图谱上显示两个杂蛋白，在电泳图上的确比离子柱少两个杂带，图上红色所示，层析依旧是有作用的。泳道4，推测是离子交换柱的穿出和wash液，目标条带区域有浅色痕迹，可能是蛋白与柱体结合不紧密，依旧有少量渗漏。5. 参考文献陈鹏 生物技术综合大实验 西北农林科技大学生物技术大实验邓超等 绿色荧光蛋白及其应用 中国生物工程杂志赵仲麟等 内含肽介导的绿色荧光蛋白纯化 河南农业大学学报 参考文献
