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1、Folin-酚法测定蛋白质含量一、 目的掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法，熟悉分光光度计的操作。二、原理Folin-酚试剂法包括两步反应：第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin 试剂）还原，产生深蓝色（磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深一、 目的掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法，熟悉分光光度计的操作。二、原理Folin-酚试剂法包括两步反应：第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin 试剂）还原，产生深蓝色（磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深浅
2、与蛋白质含量成正比。此法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100 倍，定量范围为5100g 蛋白质。Folin 试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。此外，不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。三、实验材料、主要仪器和试剂1实验材料绿豆芽下胚轴（也可用其它材料如面粉）2仪器（1）722 型（或721 型）分光光度计（2）4 000r/min 的离心机（3）分析天平（4）容量瓶（50mL）（5）量筒（6）移液管（0.5mL、1mL、5mL）3试剂（纯度均为分析纯）（1）0. 5mol/L NaOH(2) 试剂甲：（A）称取1
3、0g Na2CO3，2g NaOH 和0.25g 酒石酸钾钠，溶解后用蒸馏水定容至500mL。（B）称取0.5g CuSO45H2O，溶解后用蒸馏水定容至100mL。每次使用前将（A）液50 份与（B）液1 份，即为试剂甲，其有效期为1d，过期失效。（3）试剂乙：在1.5L 容积的磨口回流器中加入100g 钨酸钠（Na2WO42H2O）和700mL 蒸馏水，再加50mL 85 磷酸和100mL 浓盐酸充分混匀，接上回流冷凝管，以小火回流10h。回流结束后，加入150g 硫酸锂和50mL 蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15min，驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色（倘若仍呈绿色，再滴加数滴液体溴，
4、继续沸腾15min）。然后稀释至1L，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存，使用前大约加水1 倍，使最终浓度相当于1mol/L。四、操作步骤1标准曲线的制作（1）配制标准牛血清白蛋白溶液：在分析天平上精确称取0.0250g 结晶牛血清白蛋白，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解后转入100mL 容量瓶中，烧杯内的残液用少量蒸馏水冲洗数次，冲洗液一并倒入容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，则配成250g/mL 的牛血清白蛋白溶液。（2）系列标准牛血清白蛋白溶液的配制：取6 支普通试管，按表1 加入标准浓度的牛血清白蛋白溶液和蒸馏水，配成一系列不同浓度的牛血清白蛋白溶液。然后各加试剂甲5mL，混合后在室温下放
5、置10min，再各加0.5 试剂乙，立即混合均匀（这一步速度要快，否则会使显色程度减弱）。30min 后，以不含蛋白质的1 号试管为对照，用722 型分光光度计于650nm 波长下测定各试管中溶液的光密度并记录结果。（1）标准曲线的绘制：以牛血清白蛋白含量（g）为横坐标，以光密度为纵坐标绘制标准曲线。2样品的提取及测定（1）准确称取绿豆芽下胚轴1g，放入研钵中，加蒸馏水2mL，研磨匀浆。将匀浆转入离心管，并用 6mL 蒸馏水分次将研钵中的残渣洗入离心管，离心4 000r/min、20min。将上清液转入50mL 容量瓶中，用蒸馏水定容到刻度，作为待测液备用。（2）取普通试管2 支，各加入待测溶
6、液1mL，分别加入试剂甲5mL，混匀后放置10min，再各加试剂乙0.5mL，迅速混匀，室温放置30min，于650nm 波长下测定光密度，并记录结果。五、结果计算计算出两重复样品光密度的平均值，从标准曲线中查出相对应的蛋白质含量X（g），再按下列公式计算样品中蛋白质的百分含量。六、附注（1）进行测定时，加Folin 试剂要特别小心，因为Folin 试剂仅在酸性pH 条件下稳定，但此实验的反应只是在pH10 的情况下发生，所以当加试剂乙（Folin 试剂）时，必须立即混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前即能发生还原反应，否则会使显色程度减弱。（2）本法也可用于游离酪氨酸和色氨酸含量测定。七
7、、思考题1含有什么氨基酸的蛋白质能与Folin-酚试剂呈蓝色反应？2测定蛋白质含量除Folin-酚试剂显色法以外，还可以用什么方法？参考答案1含有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸）能与Folin-酚试剂反应呈蓝色，因为Folin-酚试剂在碱性溶液中极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色化合物（钼兰和钨兰混合物）。2除Folin-酚试剂显色法以外，紫外吸收法也可以进行蛋白质含量的测定。蛋白质在280nm 下具有最大的吸收值，这是由于含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸所引起的。若将已知不同浓度的蛋白质在280nm 处测定，并作标准曲线，即可求得未知溶液的蛋白质浓度。 蛋白酶活力的测定一、实验目的1、了
8、解碱性蛋白酶活力测定的原理；2、掌握碱性蛋白酶活力测定的方法。二、实验原理蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可用蛋白质或人工合成的酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。在280nm波长下测定溶液吸光度的增加，就可计算酶的活力。三、实验步骤1、将5%TCA溶液和1%酪蛋白
9、溶液在37下保温。2、取四支15ml具塞试管，分别标上记号A1,A0,B1和B0。在A1和A0试管中各吸入0.20ml酶液，在B1和B0试管中各吸入0.40ml酶液，分别用0.2mol/L磷酸盐缓冲液定容至2.00ml。在A0和B0试管中各吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液，上述四支试管都置于37水浴中保温。3、在各试管中吸入2.00ml1%酪蛋白溶液，在37下保温10min(准确计时)后，再向A1和B1试管中吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液。4、奖试管从水浴中取出，在室温下放置1h，用少量上清液润湿滤纸后过滤，保留滤出液。5、在280nm波长下，分别以A0和B0滤液为空白，测定A1和B1滤液的
10、吸光度。三、实验试剂 微生物蛋白酶萃取液（0.01g/ml）:称取1.0g酶制剂，加100ml蒸馏水搅拌30min，在4下离心分离后，将上层清夜置于冰箱中保存，使用前稀释一定倍数； 0.02mol/L磷酸盐缓冲液（PH7.5）； 1%酪蛋白溶液：取1.0g酪蛋白，加100ml 0.2mol/L磷酸盐缓冲液（PH7.5），加热并搅拌使它完全分散，然后置于冰箱中保存； 5%三氯醋酸（TCA）溶液。四、计算1、在规定的实验条件下，以每分钟增加0.001吸光度定义为一个酶单位。2、每克酶制剂中没活力的计算：A 1000 / (t w) 酶活力单位/克酶制剂式中，A样品与空白吸光度差值（即A1和B1的吸
11、光值）；t 酶作用时间（本实验为10min）; w反应中酶的用量，g五、说明1、微生物蛋白酶粗提取液在较宽广的PH范围表现出活力，但是在接近中性条件下最有最高活力。2、微生物蛋白酶在45以下可保持较长时间的稳定性。六、数据记录与处理A1 = 0.279 B1 = 0.573 酶含量为 0.001g/ml酶活力1 = A 1000 / (t w) = 0.2791000/10/0.001/0.20=1.395105酶活力单位/克酶制剂酶活力2= A 1000 / (t w) = 0.5731000/10/0.001/0.40=1.4325105酶活力单位/克酶制剂平均值= （1.395105 +
12、 1.4325105）=酶活力单位/克酶制剂平均相对相差= （ - ）/ 100%=2.65%七、思考题1、蛋白酶有哪几类？答：按蛋白酶水解蛋白质的方式：A内肽酶：切开蛋白质分子内部肽键，生成相对分子质量较小的多肽类；B外肽酶：切开蛋白质或多肽分子氨基或羧基末端的肽键，而游离出氨基酸的酶类；C水解蛋白质或多肽的酯键；D水解蛋白质或多肽的酰胺键。按酶的来源可分为：动物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋白酶微生物蛋白酶又可分为：细菌蛋白酶、霉菌蛋白酶、酵母蛋白酶和放线菌蛋白酶按蛋白酶作用的最适PH可以分为（A）PH2.55.0的酸性蛋白酶，（B）PH9.510.5的碱性蛋白酶，（C）PH78的中性蛋白酶
13、2、影响酶活力的因素有哪些？答：酶活力是酶催化某一化学反应的速率来表示的。酶活力的大小即酶含量的多少，可以用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶单位来表示，酶活力的测定也就是测定酶促反应的速率。酶浓度对酶活力的影响：酶促反应速率与酶分子的浓度呈正比，在一定范围内，当底物分子浓度足够时，酶分子越多，底物转化的速度越快。底物浓度对酶活力的影响：若酶的浓度为定值，底物的起始浓度越低时，酶促反应速度与底物浓度呈正比，即随地物浓度的增加而增加。当所有的酶与底物结合生成中间产物后，即使再增加底物浓度，中间产物浓度也不会增加，酶促反应速度也不会增加。温度对酶活力的影响：在适宜的温度范围内，酶促反应速度随温度升
14、高而增加，超过最适反应温度，酶活力将会下降。PH对酶活力的影响：酶在最适PH范围内表现出活性，大于或小于最适PH，都会降低酶活性。激活剂对酶活力的影响：某些无机阳离子、阴离子、有机化合物可作为激活剂，能够激活酶，使其表现出催化活性或强化其催化活性。抑制剂对酶活力的影响：酶的抑制剂能够减弱、抑制甚至破坏酶的活力，它可降低酶促反应速度。3、使用紫外分光光度计时应注意哪些问题？答：使用的比色皿必须洁净，并注意配对使用。手指应拿毛玻璃面的两侧，装盛样品量以2/3为度。透光面要用擦镜纸擦拭干净。比色皿使用前应用试样润洗，使用后应立即用自来水冲洗干净，倒置晾干。测定溶液的吸光度值应在0.10.7间最符合吸收定律，线性好，读数误差小。吸光值在测定前应用空白溶液校正调零，再进行测定。作业人员在生产作业时必须按规定穿符合生产作业要求的工作服，袖口与腰带必须牢牢扎紧，不得穿破损工作服，以免在机器运行或设备旋转时受到伤害
