《第二章--预处理技术(邱玉华版)》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第二章--预处理技术(邱玉华版)（18页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第二章 预处理技术第一节 概述学习目标 掌握预处理的本质；熟悉生物材料的预处理过程通常，生物物质的分离纯化是以含生物物质的溶液为出发点，进行一系列的提取和精制操作。因此，生物物质分离纯化的第一个必需步骤就是从生物材料出发，设法使所制备的目标产物转移到溶液中，同时去除其他悬浮颗粒（如培养基残渣、菌体、细胞或絮凝体等）以及改善溶液的性状，以利于后续各步操作，该过程通常称处理。生物材料的预处理过程一般有以下几个步骤动物组织和器官要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分,然后绞碎,选择适当的溶剂形成细胞悬液。植物组织和器官要先去壳、除脂,再粉碎,选择适当的溶剂形成细胞悬液。发酵液、细胞培养液、组织分泌液以及
2、制成的细胞悬液等则根据目标产物所处位不同进行相应的处理。动物细胞培养的产物大多分泌在细胞外培养液中。微生物代谢产物大多分泌到细胞外,如大多数小分子代谢物、细菌产生的碱性蛋白酶、霉菌产生的糖化酶等。分泌在细胞外的产物称为胞外产物。但有些目的产物存在于细胞内部,如大多数酶蛋白、类脂和部分抗生素等,称为胞内产物。自20世纪80年代以来,随着重组DNA技术的广泛应用,许多具有重大价值的生物产品应运而生,如胰岛素、干扰素、白细胞介素2等,它们的基因分别在宿主细胞(大肠杆菌或酵母细胞等)内克隆表达成为基因工程产品,其中许多基因工程产品都是胞内产物。而植物细胞产物多为胞内物质。对于胞外产物,一般可直接利用过
3、滤或离心方法,将菌体或其他悬浮杂质分离除去。但有些生物物质在发酵结束时部分会沉积或被吸附在菌体中,应采取措施尽可能使其转移到液相中,通常采用调节pH至酸性或碱性的方法来达到。例如四环类抗生素,由于其能与钙、镁等离子形成不溶解的化合物，故大部分沉积在菌丝中，用草酸酸化后就能转入水相，再经固液分离除去细胞(菌体)。对于胞内产物,则应首先通过离心等方法收集细胞或菌体，经细胞破碎使生物物质释放到液相中,再将细胞碎片分离除去。第二节 发酵液过滤特性的改变与相对纯化学习目标 熟悉发酵液过滤性的改变方法；掌握发酵液的相对纯化方法。 微生物发酵液的成分极为复杂,其中除了所培养的微生物菌体及残存的固体培养基外还
4、有未被微生物完全利用的糖类、无机盐、蛋白质,以及微生物的各种代谢产物。微生物发酵液的特性可归纳为:发酵产物浓度较低,悬浮液中大部分是水;悬浮物颗粒小,相对密度与液相相差不大;固体粒子可压缩性大;液相黏度大,大多为非牛顿型流体;性质不稳定,随时间变化,如易受空气氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影响;成分复杂,杂质较多,这些特性使得发酵液的过滤与分离相当困难。通过对发酵液进行适当的预处理,即可改善其流体性能,降低滤饼比阻,提高过滤与分离的速率。发酵液中杂质很多，对后步分离影响最大的是高价无机离子(Ca2+、Mg2+ 、Fe3+ )和杂蛋白等,在预处理时应尽量除去这些物质。一、发酵液过滤特性的改
5、变有关改善发酵液过滤特性的物理化学方法有调酸(等电点)、热处理、电解质处理、添加表面活性物质、添加反应剂、冷冻解冻及添加助滤剂等。1.降低液体黏度根据流体力学原理，滤液通过滤饼的速率与液体的黏度成反比,可见降低液体黏度可有效提高过滤速率。降低液体黏度的常用方法有加水稀释法和加热法等。采用加水稀释法虽能降低液体黏度,但会增加悬浮液的体积,加大后继过程的处理任务。而且,单从过滤操作看,稀释后过滤速率提高的百分比必须大于加水比才能认为有效,即若加水1倍,则稀释后液体的黏度必须下降50%以上才能有效提高过滤速率。2.调整pHpH直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质,适当调节pH可改善其过滤特性。
6、此法是发酵工业中发酵液预处理较常用的方法之一。对于氨基酸、蛋白质等两性物质,在酸性条件下带正电荷,在碱性条件下带负电荷,而在某一pH值下,净电荷为零,称为等电点。在等电点下,两性物质的溶解度最小,此即为等电点沉淀法的依据。如在味精生产中利用等电点(pH3.22)沉淀法提取谷氨酸。对于蛋白质,由于羧基的电离度比氨基大,故蛋白质的酸性性质通常强于碱性,因而大多数蛋白质的等电点都在酸性范围内(pH4.05.5)。利用酸性来调节发酵液pH使之达到等电点,可除去蛋白质等酸性物质。在膜液过滤中,发酵液中的大分子物质易与膜发生吸附,通过调整pH改变易吸附分子的电荷性质,即可减少堵塞和污染。此外,细胞、细胞碎
7、片及某些胶体物质等在某个pH下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒,有利于过滤的进行。3.加入反应剂有时,加入某些不影响目的产物的反应剂,可消除发酵液中某些杂质对过滤的影响，从而提高过滤速率。加入反应剂可和某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀,如CaSO4、AlPO4等。生成的沉淀能防止菌丝体黏结,使菌丝具有块状结构,沉淀本身可作为助滤剂,并且能使胶状物和悬浮物凝固,从而改善过滤性能。如在新生霉素发酵液中加入氯化钙和磷酸钠,生成的磷酸钙沉淀可充当助滤剂,另一方面可使某些蛋白质凝固。又如环丝氨酸发酵液用氧化钙和磷酸处理,生成磷酸钙沉淀,能使悬浮物凝固,多余的磷酸根离子还能除去钙离子、镁离子,并且在发酵液
8、中不会引人其他阳离子,以免影响环丝氨酸的离子交换吸附。正确选择反应剂和反应条件,能使过滤速率提高310倍。如发酵液中含有不溶性多糖物质，则最好用酶将其转化单糖，以提高过滤速率。例如万古酶素用淀粉作培养基，发酵液过滤前加入0.025%的淀粉酶，搅拌30min 后，再加2.5%硅藻土助滤剂，可使过滤速率提高5倍。4.加入助率剂助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，滤速增大。这是因为充当过滤介质的助滤剂表面具有吸附胶体的能力，并且由此助滤剂颗粒形成的滤饼具有格子型结构，不可压缩，滤孔不会被全部堵塞，可能保持良好的渗透性，既能使悬浮液中细小颗粒状胶态物质截留在格子骨架上，又能使清液有流畅的通
9、道。所以使用惰性助滤剂能大大提高过滤能力和生产效率，改善滤液澄清度，降低过滤成本。常用的助滤剂有硅藻土、纤维素、石棉粉、珍珠岩、白土、炭粒、淀粉等、其中最常用的是硅藻土。助滤剂的使用方法有两种:一种是在过滤介质表面预涂助滤剂，另一种是直接加入发酵液，也可两种方法同时兼用。采用第一种方法，在一个旋转真空过滤机的转鼓上，预涂上助滤剂,就可以对非常细小或可压缩的低固含量（5%）悬浮液进行过滤。在改进的旋转真空过滤机上，采用一把缓慢向鼓面移动的刮刀，在操作时，将滤饼连同一层助滤剂一起刮去，使过滤表面不断更新，以维持正常的过滤速度，直到助滤剂被全部移走后，再重新涂层。采用第二种方法，则多数是将助滤剂与压
10、滤机结合起来使用，对于菌体较细小、黏度较大的发酵液，可加放助滤剂后进行压滤，或者先将含助滤剂的悬浮液通过压滤机，形成过滤介质，然后对混有助滤剂的料液进行过滤，这样可提高滤饼的渗透性。对于后一种方法，使用时要有一个带搅拌器的混合槽，充分搅拌混合均匀，防止分层沉淀。助滤剂的微粒大小、粒度分布及添加量对过滤速度影响很大。应针对不同的发酵液和过滤要求，通过过滤实验，优选最佳的助滤剂。一般在助滤剂用量等于进料中固体含量时，滤速最快。但是，使用助滤剂对发酵液预处理的方法也不足之处，因为粒度微细的助滤剂会降低滤液澄清度，另外某些抗生素还会与硅藻土产生不可逆的结合。二、发酵液的应对纯化发酵液中杂质很多，其中有
11、些杂质不仅直接影响产品质量和收率，同时对后继提取和精制有很大影响。如高价无机离子的存在，在采用离子交换法提取时，会影响树脂对生化物质的交换容量。可溶性蛋白质的存在，不仅在采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力，而且在使用有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化现象，使两相分离不清。此外，在常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞或受污染，影响过滤速率。因此，在预处理时，必须采用适当的方法使这些杂质沉淀，在固-液分离除去，以利于以后提取与精制过程的顺利进行。1.高价无机离子的去除发酵液中主要的无机离子有Ca2+、Mg2+ 和Fe3+等。Ca2+的去除通常使用草酸。但草酸溶解度较小，故用量大
12、时，可用其溶性盐（如草酸钠）。反应生成的草酸钙还能促进蛋白质凝固，改善发酵液的过滤性能。但草酸价格较贵，应注意回收。如四环类抗生素废液中，加入硫酸铅，在60下反应生成草酸铅。后者在9095下用硫酸分解，经过滤，冷却，结晶后可以回收草酸。草酸镁的溶解度较大，虽然发酵液中Mg2+的浓度一般不是很高，到加入草酸不能除尽Mg2+。要除去Mg2+，可以加入三聚磷酸钠（Na5P3O10），它和Mg2+形成可溶性络合物。Na5P3O10 Mg2+MgNa3P3O102Na+用磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和镁离子的浓度。要除去Fe3+，可加入黄血盐，使形成普鲁士蓝沉淀。4Fe3+ +3K4Fe(CN)6 F
13、e4Fe(CN)63+12K+2.杂蛋白的去除在发酵液中除了上述高价无机离子外,还存在有可溶性蛋白质。发酵液的预处理,从根本上说,是如何使可溶性蛋白质充分变性沉淀,以便随固形物一同除去。改善发酵液过滤特性的方法中,其中许多可在改善过滤特性的同时除去杂蛋白。下面介绍几种常用的方法。(1)沉淀法 蛋白质是两性物质,在酸性溶液中,能与一些阴离子如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等的酸根离子形成沉淀;在碱性溶液中,能和一些阳离子如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+和Pb2+等形成沉淀。(2)变性法 蛋白质从有规则的排列转变成不规则结构的过程称为变性。变性蛋白质的溶解度较小。使
14、蛋白质变性的方法很多,其中最常用的是加热法。加热不仅使蛋白质变性，同时降低液体黏度,提高过滤速率。例如,将柠檬酸发酵液加热至80C以上,使蛋白质变性凝固和降低发酵液黏度,即可大大提高过滤速率。使蛋白质变性的其他方法有大幅度调节PH以及加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。如在抗生素生产中,常将发酵液pH调至偏酸性范围(pH23)或较碱性范围(pH89)使蛋白质凝固，一般以酸性条件下除去的蛋白质较多。变性法存在一定的局限性,如热处理通常对原液质量有影响,特别是会使色素增多,该法只适用于对热较稳定的生化物质,否则容易使其破坏,同时对某些生化物质效果也并不是很理想;极端pH也会导致某些目的产物失活,
15、并且要消耗大量酸碱;而加有机溶剂成本高,通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。(3)吸附法 加人某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白而将其除去。例如在四环类抗生素中，采用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚铁氰化锌钾(K2Zn3Fe(CN)62)的胶状沉淀来吸附蛋白质,利用此法除去蛋白质已取得很好的效果。在枯草芽孢杆菌发酵液中加入氯化中,钙和磷酸氢二钠,两者生成庞大的凝胶,把蛋白质、菌体及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去,从而可加快过滤速率。第三节 凝聚和絮凝技术学习目标:熟悉凝聚的原理；掌握絮凝的基本原理和影响因素；掌握絮凝剂的选择方法。使用凝聚和絮凝技术能有效地改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分
16、散状态，使其凝集起来，从而增大体积，以便于固液分离，常用于菌体细小而且粘度大的发酵液的预处理中。过去常常混淆凝聚与絮凝的概念，现在趋于明确区分开来。凝聚是指在电解质作用下，由于胶粒之间双电层电排斥作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳定的现象。絮凝则是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，使胶粒形成较大絮凝团的过程。一、凝聚发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子的表面一般带有电荷，带电的原因很多，主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。通常发酵液中细胞或菌体带有负电荷，由于静电引力的作用使溶液中带有相反电荷的粒子（即正离子），被吸附在其周围，在其界面上形成了双电子层，如图21所示，这种双电层的结构使胶粒之间不易聚集而保持稳定的分散状态。双电层的电位越高，电排斥的作用越强，胶体粒子的分散程度也就越大，发酵液过滤就越
