细胞生物学试验指导

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1、细胞生物学实验指导 细胞生物学的发展总是依赖于技术和实验手段的进步,所以学习细胞生物学的技术和方法至关重要。 实验一 普通显微镜及其使用（装片观察）一、 目的要求： 1、掌握显微镜的构造、油浸系的原理、使用方法、保护要点。 2、参观了解其他各类显微镜。 二、 材料：普通光学显微镜及其他显微镜、细菌标本片、香柏油、二甲苯、擦镜纸。 三、 方法和步骤： 1、 介绍普通光学显微镜的构造 机械部分：镜座、镜臂、镜筒、 转换器、载物台、调焦螺旋。 光学部分：接目镜、物镜、反光镜、聚光器。 2、 油镜的原理及使用方法 原理：油镜头的晶片细小，进入镜中的光线亦少，光线经聚光器，通过载玻片进油镜时，由于空气介

2、质和玻璃介质的折射率不一样，光线因折射而损失，使视野更暗。在载玻片和油镜之间加上和玻璃折光系数相同的香柏油，光线直接进入镜头，不发生折射，视野明亮，便于观察。3、 如何维护显微镜：机械部分的维护，光学部分的维护。 4、 注意事项： （1）观察油镜载片时，先在载片上有菌影的地方滴1-2滴香柏油，然后放载物台中央，眼侧面看，慢慢降低油镜浸入香柏油中，镜头几乎接触标本。再用左眼在接目镜观察，同时慢慢旋动粗螺旋提起镜筒至能模糊看到物象时，再转动微调螺旋，直至看清晰为止。注意镜头离开油，就不能看清，重新按刚才的步骤进行。 （2）油镜使用过后，立即用擦镜纸擦拭镜头，如油渍已干，则可用香柏油粘二甲苯擦拭镜头

3、，再用干净擦镜纸擦去二甲苯。 5、 观察几种细菌标本片。 6、 示教看相差显微镜和荧光显微镜。 四 、作业及思考题： 1、 油镜的原理是什么？2、 光线强弱如何调节？与哪些部件有关？ 实验二、细胞膜的渗透性实 验 目 的 了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。 实 验 原 理 将红细胞放入数种等渗溶液中，由于红细胞对各种溶质的透性不同，有的溶质可以渗入，有的不能渗入，渗入的溶质能够提高红细胞的渗透压，所以促使水分进入细胞，引起溶血，由于溶质透入速度互不相同，因此溶血时间也不相同。 实 验 用 品 一、器材 50ml烧杯, 试管（110cm）, 10ml移液管, 试管架。 二、材料 羊血。

4、 三、试剂 0.17mol/L氯化钠，0.17mol/L氯化胺，0.17mol/L醋酸胺，0.17mol/L硝酸钠，0.12mol/草酸胺，0.12mol/硫酸钠，0.32mol/葡萄糖，0.32mol/甘油，0.32mol/乙醇，0.32mol/丙酮。 实 验 方 法 一、羊血细胞悬液取50ml小烧杯一个，加1份羊血和10份0.17mol/L氯化钠，形成一种不透明的红色液体，此即稀释的羊血。二、低渗溶液取试管一支，加入10ml蒸馏水，再加入1ml稀释羊血，注意观察溶液颜色的变化，有不透明的红色逐渐澄清，说明红细胞发生破裂造成100%红细胞溶血，使光线比较容易透过溶液。三、羊红细胞的渗透性1、

5、取试管一支，加入0.17mol/L氯化钠10ml，再加入1ml稀释羊血，轻轻摇动，注意观察溶液颜色有无变化？有无溶血现象？为什么？2、取试管一支，加入0.17mol/L氯化胺10ml，再加入1ml稀释羊血，轻轻摇动，注意观察溶液颜色有无变化？有无溶血现象？为什么？3、分别在另外8种等渗溶液中进行同样实验。步骤同2。实 验 结 果并对实验结果进行比较和分析。实验三、线粒体和液泡系的超活染色与观察 活体染色是能使生活有机体的细胞或组织特异性着色但对活样品又没有毒害作用的一种活体染色方法，其目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。活体染色技术

6、可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。 通常把活体染色分为体内活体染色与体外活体染色两类。体外活体染色又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是靠染料的“电化学”特性。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。但并非任何染料均可用于活体染色，理论上应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，且使用时需要配成稀淡的溶液。一般说来，最为适用的是碱性染料，这可能是因为它具

7、有溶解在类脂质(如卵磷脂、胆固醇等)的特性，易于被细胞吸收。詹纳斯绿B(Janus green B)和中性红(neutral red)两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色分别具有专一性。 实 验 目 的1、观察动、植物活细胞内线粒体、液泡系的形态、数量与分布； 2、学习一些细胞器的超活染色技术。实 验 原 理 线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿 B是线垃体的专一性活体染色剂。

8、线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态(即有色状态)呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。中性红为弱碱性染料，对液泡系(即高尔基体)的染色有专一性，只将活细胞中的液泡系染成红色，细胞核与细胞质完全不着色，这可能是与液泡中某些蛋白质有关。 实 验 用 品1、器材 显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、镊子、双面刀片、解剖盘载玻片、凹面载玻片、盖玻片、表面皿、吸管、牙签、吸水纸。 2、试剂（1）Ringer溶液： 氯化钠 0.85g (变温动物用0.65g) 氯化钾 0.25g 氯化钾 0.25g 氯化钙 0.03g 蒸馏水 100ml （2）10%、1/3000中性红溶液： 称取0

9、.5g中性红溶于50ml Ringer液，稍加热 (3040)使之很快溶解，用滤纸过滤，装入棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀，失去染色能力。临用前，取已配制的1%中性红溶液1ml，加入29ml Ringer溶液混匀，装入棕色瓶备用。（3） 1%、1/5000詹纳斯绿B溶液 称取50mg詹纳斯绿B溶于5ml Ringer溶液中，稍加微热(3040)，使之溶解，用滤纸过滤后，即为1%原液。取1%原液l ml加入49ml Ringer溶液，即成1/5000工作液装入瓶中备用。最好现用现配，以保持它的充分氧化能力。 实验材料 人口腔上皮细胞，小麦种子或黄豆幼根根尖。实 验 方 法1、人口腔粘膜上皮细胞

10、线粒体的超活染色与观察清洁载玻片放在37恒温水浴锅的金属板上 滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液 用牙签口腔颊粘膜处稍用力刮取上皮细胞 刮下的粘液状物放大载玻片的染液滴中 染色10l5min(注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液) 盖上盖玻片,显微镜下观察 2、植物细胞液泡系的超活染色与观察 取豆芽的根尖 用刀片纵切根尖 放入中性红染液滴中，染色510min。 吸去染液，滴一滴Ringer液 盖上盖玻片进行镜检(镊子轻轻地下压盖玻片，使根尖压扁，利于观察) 实 验 结 果 在高倍镜下，先观察根尖部分的生长点的细胞，可见细胞质中散在很多大小不等的染成玫瑰红色的圆形小泡，这是初生的幼小液泡。然后，

11、由生长点向延长区观察，在一些已分化长大的细胞内，液泡的染色较浅，体积增大，数目变少。在成熟区细胞中，一般只有一个淡红色的巨大液泡，占据细胞的绝大部分，将细胞核挤到细胞一侧贴近细胞壁处。实验报告（1）. 绘口腔上皮细胞示线粒体的形态与分布 （2）. 绘蟾蜍胸骨剑突软骨细胞示液泡系的形态与分布实验四、叶绿体的分离与荧光观察实 验 目 的 1. 通过植物细胞叶绿体的分离, 了解细胞器分离的一般原理和方法。 2. 观察叶绿体的自发荧光和次生荧光, 并熟悉荧光显微镜的使用方法。 实 验 原 理 将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L

12、氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行, 以免渗透压的改变使叶绿体到损伤。将匀浆液1000r/min的条件下离心2min, 以去除其中的组织残渣和未被破碎的完整细胞。然后，在3000r/min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。分离过程最好在05的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。 利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间, 有必要时立即拍照。另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。 实 验 用 品 一、器材 1.主要设备: 普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显

13、微镜。 2.小型器材: 500ml烧杯2个, 250ml量筒1个, 滴管20支, 10ml刻度离心管20支, 试管架5个，纱布若干，无荧光载片和盖片各4片。 二、材料 新鲜菠菜。 三、试剂 0.35mol/L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙(acridine orange)。 实 验 方 法 一、叶绿体的分离与观察 1. 选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称30g于150ml 0.35mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机。 2. 利用组织捣碎机低速(5000r/min)匀桨35min。 3. 将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。 4. 取滤液4ml在1000r/min下离心2mi

14、n。弃去沉淀。 5. 将上清液在3000r/min下离心5min。弃去上清液，沉淀即不叶绿体(混有部分细胞核)。 6. 将沉淀用0.35mol/LNaCl溶液悬浮、 7. 取叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，加盖玻片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察。 (1)在普通光镜下观察。 (2)在荧光显微镜下观察叶绿体的直接荧光。 (3)在荧光显微镜下观察叶绿体的间接荧光：取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上，再滴加一滴0.01%吖啶橙荧光染料, 加盖片后即可在荧光显微镜下观察。 二、菠菜叶手切片观察 用剔须刀片将新鲜的嫩菠菜叶切削出一斜面置于载玻片上，滴加12滴0.35mol/L NaCl溶液，加盖片后轻压，置显微镜下观察。 (1)在普通光镜下观察。 (2)在荧光显微镜下观察其直接荧光。 (3) 观察间接荧光：向手切片上滴加12滴0.01%吖啶橙染液，染色1min，洗去余液, 加盖片后可在荧光显微镜下观察间接荧光。 实 验 结 果 一、叶绿体的分离和观察 1. 普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。 2. 以Olympus荧光显微镜为例，在