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1、端粒的复制一、双链DNA复制末端的丢失 对于所遇的生物而言DNA的复制永远是遗传的关键步骤。而对于双链DNA而言，其复制方法是半保留复制。即复制所形成的新的DNA分子中，保留了原来亲本的DNA双链分子中的一条单链。并且合成是有方向的只可以从5到3的方向合成。所以在合成中就形成了先导链和滞后链，而滞后链的合成中会形成岗崎片段，而这些岗崎片段的合成都需要一种特别的RNA聚合酶的作用下先合成一小段RNA“引物”，由此提供一个3OH端。只有这样，DNA聚合酶才能够在“引物”的帮助下延伸复制。当链复制延伸反应启动后，这些RNA“引物”将会被除去，而中间的断层却因为其5端方向的DNA片段的末端有3OH端，
2、使DNA聚合酶可以补齐断层。但是末端的DNA引物的5端方向没有DNA片段提供3OH端，这样就使得在新链的最末端留下了一段无法填补的空缺。这样没复制一次DNA的末端就会愈来愈短，甚至产生遗传信息的丢失（见图一）。这就是最早人们所发现的DNA末端复制难题，也是人们开始研究末端复制的开端。但是实际上，生物在繁衍的过程中并不没有出现这种遗传信息不断丢失的问题，所以人们开始研究生物体是如何来回避这个问题的。1. 原核生物的DNA末端复制的方法首先原核生物的遗传信息量相对真核生物来说要小的多，而且其遗传信息的载体仅仅是一个DNA环状分子。这种DNA的构型就决定了原核生物根本不存在DNA末端复制问题。而且综
3、合DNA末端丢失的原因和图一，可以很容易的想象出当模板链是环状时，为什么原核生物的DNA复制不会出现末端丢失。2.病毒DNA（或RNA）的末端复制的方法病毒是一种非细胞形态的生命体，并且其遗传物质可以是双链的DNA，单链的DNA还可以是单链或者是双链的RNA这四类，所以其复制终止的方式也多种多样。对具有环状DNA分子的病毒而言, 其复制终止的方式与原核生物基本相同。原核病毒, 如T4和T7噬菌体等的DNA也是线性分子, 其DNA 两端各有一段重复的数百个核甘酸, 称为末端冗余。这意味着两个子代分子中的单链末端可以互补, 多余的部分可以被DNA 酶除去。因此, 它们采用病毒基因组末端互相融合形成
4、多连体的方法, 利用相邻病毒DNA 新链的3OH 端为引物复制自身, 从而达到完全复制的目的。动物病毒多数也是线性分子, 在长期的进化过程中, 它们选择的末端复制策略与上述几类原核生物又不尽相同。细小病毒在其单股DNA 末端有一正向和反向的重复序列, 这一回文片段能在末端形成鬓夹形结构, 使得合成新链折回补齐5端空缺。腺病毒则利用一种特殊的蛋白质与5 端共价连接。这种特殊蛋白质被称作末端蛋白质, 简写为TP。TP 以其丝氨酸轻基通过磷酸二醋键与5端的胞嗜陡共价连接。参与腺病毒DNA复制起始的是末端蛋白质的前体物, 简写为pTP。pTP 不但作为蛋白质引物解决了腺病毒DNA 的复制起始问题, 而
5、且这种引发方式避免了线形DNA在复制结束时所面临的5末端隐缩问题。除腺病毒外, 枯草杆菌噬菌体29 和脊髓灰质炎病毒(一种RNA病毒), 也采用这种借助蛋白质介入的方法。痘病毒和疤疹病毒则和T4,T7噬菌体一样, 都是以多连体的形式达到完全复制的。3.真核生物的DNA末端复制的方法在真核生物中，端粒的丢失在每次复制中是不可以避免的，因此在真核生物中，就有了一套自己的体系去处理这个问题，那就是在端粒酶的作用下进行端粒的复制。下面我们将更详细的去解释这个问题。二真核生物DNA端粒的复制工作研究的发展过程20 世纪30 年代，遗传学家Mc Clintock 和Muller 分别在玉米和果蝇中发现损伤
6、断裂后的染色体末端之间极易发生连接，从而形成各种类型的染色体畸变，如末端融合形成环状体或形成双着丝点染色体但染色体的天然末端似乎从来不与染色体断裂产生的那种末端连接，天然末端之间也不结合，就像有一顶“帽子”那样维持着染色体末端的稳定于是Muller 提出位于染色体两端的片段在细胞里具有重要的作用，并命名它为端粒(Telomere)，这是由希腊语“末端”(Telos)及“部分”(Meros)组成的20 世纪70 年代，Blackburn 利用四膜虫(Tetrahymena)进一步揭示了端粒的初步结构，发现它是由几个核苷酸(富含G)组成的DNA 重复片断，重复的次数由几十到数千不等1972 年，W
7、atson 发现了这样一个问题，即DNA 多聚酶是不能够复制线性染色质的全部的，由于在末端缺少5端的引物，DNA多聚酶将不能完成最后的复制工作，而留下一个单链的间隙如果这一间隙不能被填充的话，染色体DNA 将失去这一DNA 片断，这样的话，每经过一次复制、分裂，染色体就将丢失一部分的端粒结构，直至影响到与端粒相邻的一些重要基因因此科学家们考虑是否存在着一种不同于DNA 多聚酶的酶来完成这一工作1984 年，Greider 和Blackburn 发现将一段单链的末端寡聚核苷酸加至四膜虫的提取物中后，端粒的长度延长了，这说明确实有这样一种酶存在，将它命名为“端粒酶”(Telomerase)进一步的
8、研究揭示了端粒与端粒酶在细胞的生长及肿瘤预防和防治中有非常重要的意义下图图二为四膜虫DNA端粒合称示意图。三.端粒及端粒酶1.端粒的概念端粒是真核细胞染色体线形DNA 分子末端具特殊结构的序列。它是一段十分简单、多次重复的DNA 序列和端粒结合蛋白组成。序列的主要特征是富含G 和T, 如人和其他脊椎动物的端粒重复单位为AGGGTT; 四膜虫的重复单位为GGGGTT 和GGGGTTTT 等, 它们多次重复长度可达几百到几千碱基对。端粒DNA 的序列具有一定的取向特征, 即在双链DNA 末端, 富含G 的一股链总是由5向3末端延伸, 并比互补的富含C 链长12至 16 个核苷酸 。真核生物染色体末
9、端的端粒结构, 由于富含G,且在3末端形成一段单链突出序列, 因此在正常生理条件下, 可通过GG 间非标准配对, 在突出的3端形成分子内G 四联体( 四股螺旋结构) , 也可以由两个DNA 分子或染色体彼此连接成一个局部的分子间四联体( 图3) 。图3 G 四联体螺旋结构(a) 分子内四联体螺旋 (b) 双分子间四联体螺旋(c) 两个DNA 分子或染色体末端连接起来而形成局部四螺旋结构。2.端粒酶的概念端粒酶是一种能将真核生物染色体末端DNA端粒DNA 加以延伸的酶它是一种核酸蛋白质复合物目前认为端粒酶是由端粒酶RNA 组分(telomerase RNA，TR)，端粒酶相关蛋白和端粒酶催化亚基
10、(telomerase reverse transcriptase，TERT)三部分组成的蛋白质复合物(6，7)端粒酶结构中的核酸部分为RNA，又分为模板区与非模板区模板区决定所合成端粒的特异性，非模板区具有酶与底物的结合位点模板区的长度一般为端粒重复序列长度的11.5 倍不同物种端粒酶RNA 部分的核苷酸组成存在差异如最早研究的四膜虫端粒酶RNA 为159 nt 的小RNA，其中46，47 和48 位的核苷酸被修饰过，而这一位置有CAACCCCAA 结构，可与四膜虫端粒的重复序列TTGGGG 互补又如Euplotes(游仆虫)端粒酶RNA有191 个核苷酸，模板区为5CAAAACCCCAAA
11、，小鼠端粒酶RNA 有430 个核苷酸，模板区为5CCUAACCCUGAG，大鼠端粒酶RNA 模板区为5UCUAACCCUAUU，中国仓鼠端粒酶RNA 模板区为5UCUAACCCUGAA 1995 年，Feng 等克隆了人类端粒酶RNA 基因(hTR 基因，位于3p6.3)，在长约450 个碱基的人端粒酶 RNA 序列中，有一段长11 个核苷酸的区域(5-CUAACCCUAAC-3)与人端粒序列(TTAGGG)n 互补，发生在该模板区域的hTR 突变将导致端粒酶功能的改变对已研究的不同物种的端粒酶进行比较发现，它们之间的RNA 链同源性较低，将脊椎动物的TR二级结构与四膜虫的比较发现，它们的二
12、级结构非常相似，有4 处发卡结构形成4 个小的和一个大的环形单链区，端粒DNA 的模板RNA 即位于此区内端粒的延长即通过该区与端粒DNA 结合后进一步完成1995 年，Greider 等在四膜虫中分离出两种端粒酶蛋白亚单位p80 和p95，并且克隆出它们的基因1997 年在人、小鼠、大鼠中也克隆了四膜虫p80的同源物，在人与小鼠中称为TP1，在大鼠中称为TLP1TP1 和TLP1 有一与p80 同源的结构域，位于氨基末端，这正是与TR 特异性结合的部位对TP1 和TLP1 的mRNA 的表达并不限于有端粒酶活性的组织和细胞系，各组织间的水平差异与端粒酶活性无关因此，端粒酶活性的表达并不是由这
13、一部分决定的端粒酶的 TERT 组分最先在游仆虫中被鉴定出，随后在包括人、老鼠、裂殖酵母、芽殖酵母等有机体内都检测到了端粒酶催化亚基活性的存在并克隆出了它们的TERT 基因端粒酶的催化亚基从游仆虫到酵母到人结构都非常保守，它们都含有端粒酶特有基元T 和7 个保守的反转录酶基元端粒酶催化亚基中氨基酸的保守性对端粒酶发挥其正常的功能起重要作用1999 年研究清楚了人类hTERT(Human telomerasereverse transcriptase)的基因结构它超过37kD，并且由16 个外显子组成，制造127 kD的hTERT和一个新的断裂变异体转录起始点在hTERT 的cDNA 首位核苷酸
14、上游19 bp 处启动子区域不包含TATA 和CAAT 盒，结构是富含GC 的CpG 岛，并包括由ATG 起始密码上游的1 100 bp，其核心启动子有181 bp，包括一个c-myc 结合点，E-盒(CACGTG)和一个转录子Sp1体外转化研究证实hTERT 在转录水平调控是一个直接的途径与P123(游仆虫)、Est2P(芽殖酵母)和Tri1P(裂殖酵母)端粒酶的催化亚基进行序列分析和比较，hTERT 在保守区域和它们具有广泛的序列一致性(46%49%)所有这些端粒酶催化亚基都具有逆转录酶的共同结构即7 个蛋白质域以及端粒酶催化亚基独特的保守区域，称为T 模体，位于多肽的中间和7 个保守的逆
15、转录模板(RT)的上游，去除T 模体(560FFYVTE565)或单个氨基酸变异(如F561A)会显著降低端粒酶活性以及与TR 的结合能力另外，在延长的N 末端区，还发现了另一个端粒酶特异性结构T2 模体，对T2 模体的单个氨基酸残基进行选择性变异，同样也会导致端粒酶活性丧失最近发现存在hTERT-mRNA 的不同剪接体HTERTa 剪接体在逆转录酶区域A 内丢失12个氨基酸，hTERTdeta 剪接体在逆转录酶区域B 上游丢失182 个碱基，造成下游的移码突变另外一剪接体编码变异羧基重组实验表明只有完整的hTERT 转录产物才表达端粒酶活性在人组织器官发育过程中，这些剪接体可能替代全长hTERT，改变端粒酶活性不同的hTERT 蛋白也有可能组成一系列端粒酶全酶，在细胞分化不同阶段发挥不同的生理功能在大多数情况下，hTERT 的表达是端粒酶活性表达的限速步骤四端粒的复制 通过对四膜虫DNA 端粒合成的研究发现, 当DNA 端粒复制时, 端粒酶催化逆向转录作用,
