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1、第九章 环境卫生微生物检验第一节 化妆品微生物检验化妆品是指以涂擦、喷洒或者其他类似的方法，散布于人体表面任何部位（皮肤、毛发、支架、口唇等），以达到清洁、消除不良气味、护肤、美容和修饰目的的日用化学工业产品。在正常以及合理的、可预见的使用条件下，化妆品不得对人体健康产生危害。化妆品的微生物学质量应符合下列规定：眼部化妆品及口唇等黏膜用化妆品以及婴儿和儿童用化妆品菌落总数不得500CFU/mL或500CFU/g。其他化妆品菌落总数不得1000CFU/mL或1000CFU/g。每克或每毫升产品中不得检出粪大肠菌群、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。化妆品中霉菌和酵母菌总数不得100CFU/mL或10
2、0CFU/g。化妆品的直接接触容器材料必须无毒，不得含有或释放可能对使用者造成危害的有毒物质。一、样品的采集及注意事项1、所采集的样品，应具有代表性，一般视每批化妆品数量大小，随机抽取相应数量的包装单位。检验时，应分别从两个包装单位以上的样品中共取10g或10mL。包装量16g。2、供检验样品，应严格保持原有的包装状态。进口产品应为市售包装。容器不应有破裂，在检验前不得打开，防止样品被污染。3、接到样品后，应立即等级，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。如不能及时检验，样品应放在室温音量干燥处，不要冷藏或冷冻。4、若只有一个样品而同时需做多种分析，如细菌、毒理、化学等，应先做微生物检验，再将剩
3、余样品做其他分析。5、在检验过程中，从打开包装到全部检验操作结束，均需防止微生物的在污染和扩散，所用采样用具、器皿及材料均应事先灭菌，全部操作应先在无菌室内进行，或在相应条件下，按无菌操作规定进行。6、若检出粪大肠菌群或其他致病菌，自报告发出之日起该菌种及备检样品应保存一个月。二、供检样品的制备（一）液体样品1、水溶性的液体样品可量取10mL加到90mL灭菌生理盐水中，如样品少于10mL，仍按10倍稀释法进行。如为5mL则加到45mL灭菌生理盐水中，混匀后，制成1:10检液。2、油性液体样品取样品10mL，先加到5mL灭菌液状石蜡混匀，再加10mL灭菌的吐温80，在4044水浴中振荡混合10分
4、钟，加入灭菌生理盐水75mL（在4044水浴中预温），在4044水浴中乳化，制成1:10的悬液。（二）膏、霜、乳剂半固体状样品1、亲水性样品称取10g，加到装有玻璃珠及90mL灭菌生理盐水的三角瓶中，充分振荡混匀，静置15分钟。用其上清液作为1:10检液。2、疏水性样品称取10g，放到灭菌的研钵中，加10mL灭菌液状石蜡，研磨成黏稠状，再加入10mL灭菌吐温80，研磨待溶解后，加70mL灭菌生理盐水，在4044水浴中充分混合，制成1:10检液。 （三）固体样品称取10g，加到90mL灭菌生理盐水中，充分振荡混匀，使其分散混悬，静置后，取上清液作为1:10检液。如有均质器，上述水溶性膏、霜、粉剂
5、等，可称10g样品加入90mL灭菌生理盐水，均质12分钟；疏水性膏、霜及眉笔、唇膏等，称10g样品，加10mL灭菌液状石蜡，10mL灭菌吐温80,70mL灭菌生理盐水均质35分钟。三、化妆品微生物指标检验方法（一）菌落总数菌落总数（aerobic bacterial count）是指化妆品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成分、培养温度、培养时间、pH、需氧性质等），1g（1mL）检样中所含菌落的总数。所得结果只包含一群本方法规定的条件下生长的嗜中温的需氧性菌落总数。测定菌落总数便于判明样品杯细菌污染的程度，是对样品进行卫生学总评价的综合依据。1、检验步骤 （1）用灭菌吸管吸取1：10
6、稀释的检液2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1mL。另取1mL注入到9mL灭菌生理盐水试管中（注意勿使吸管接触液面），更换一支吸管，并充分混匀，制成1:100检液。吸取2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1mL。如样品含菌量高，还可再稀释成1：1000、1：10000、，每种稀释度更换一支吸管。（2）将融化并冷至4550的卵磷脂吐温80营养琼脂培养基倾注到平皿内，每皿约15mL，随即转动平皿，使样品与培养基充分混合均匀，待琼脂凝固后，翻转平民，置361培养箱内培养482小时。另取一个不加样品的灭菌空平皿，加入约15mL卵磷脂吐温80营养琼脂培养基，待琼脂凝固后，翻转平皿，置361培养箱内
7、培养482小时，为空白对照。（3）为便于区别化妆品中的颗粒与菌落，可在没100mL卵磷脂吐温80营养琼脂中加入1mL0.5%的TTC溶液，如有细菌存在，培养后菌落呈红色，而化妆品的颗粒颜色无变化。2、菌落计数方法先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大510倍的放大镜检查，以防遗漏。记下各平皿的菌落数后，求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数。若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该平皿不宜计数。若片状菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落数分布很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘以2，以代表全皿菌落数。3、菌落计数及报告方法（1）首先选取平均菌落数在30300个之间的平皿，作为菌落总数
8、测定的范围，每当有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即以该平皿菌落数乘其稀释倍数（见表9-1中例1）。（2）若有两个稀释度，其平均菌落数均在30300个之间，则应求出两菌落总数之比值来决定，若其比值小于或等于2，应报告其平均数，若大于2则报告期中稀释度较低的平皿的菌落数（见表9-1中例2及例3）。（3）若所有稀释度的平均菌落数均300个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表9-1例4）。（4）若所有稀释度的平均菌落数均300个，而相邻的另一稀释度30个时，则以接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表9-1中例6）（6）若所有的稀释度均无菌生长，报告数为每克或每毫升
9、100时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，应以四舍五入法计算。为了缩短数字后面零的个数，可用10的指数来表示（见表9-1报告方式栏）。在报告菌落数为“不可计”时，应注明样品的稀释度。表9-1 细菌计数结果及报告方式例次不同稀释度平均菌落数两稀释度菌数之比菌落总数CFU/mL或CFU/g报告方式CFU/mL或CFU/g10-110-210-31136516420-1640016000或1.610422760295461.63800038000或3.810432890271602.22710027000或2.71044不可计4650513-或5.1105527115-270270或2.
10、71026不可计30512-3050031000或3.11047000-11010CFU：菌落形成单位（二）粪大肠菌群粪大肠菌群（Fecal conliforms）系一群需氧及兼性厌氧革兰阴性无芽胞杆菌，在44.50.5培养2448小时能发酵乳糖产酸产气。该菌直接来自粪便，是重要卫生指标菌。1、检验步骤（1）取10mL 1:10稀释的检液，加到10mL双倍乳糖胆盐（含中和剂）培养基中，置440.5培养箱中培养2448小时，如不产酸也不产气，则报告为粪大肠菌群阴性。（2）如产酸产气，划线接种到伊红亚甲蓝琼脂平板上，置361培养1824小时。同时取该培养液12滴接种到蛋白胨水中，置440.5培养2
11、42小时。经培养后，在上述平板上观察有无典型菌落生长。粪大肠菌群在伊红亚甲蓝琼脂培养基上典型菌落呈深紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽。也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉紫色，中心较深的菌落，亦常为粪大肠菌群，应注意挑选。（3）挑取上述可疑菌落，涂片革兰染色镜检。（4）在蛋白胨水培养液中，加入靛基质试剂约0.5mL，观察靛基质反应。阳性者液面呈玫瑰红色；阴性反应液面呈试剂本色。2、检验结果报告根据发酵乳糖产酸产气，平板上有典型菌落，并经证实为革兰阴性短杆菌，靛基质试验阳性，则可报告被检样品中检出粪大肠菌群。（三）铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeru
12、ginosa）属于假单胞菌属，为革兰阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌素。此外还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，在421条件下能生长。该菌对人有致病力，可使伤处化脓，引起败血症等。1、检验步骤（1）增菌培养：取1:10样品稀释液10mL加到90mL SCDLP液体培养基中，置361培养1824小时。如有铜绿假单胞菌生长，培养液表面多有一层薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色。（2）分离培养：从培养液的薄膜处跳取培养物，划线接种在十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上，置361培养1824小时。凡铜绿假单胞菌在此培养基上，其菌落扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有
13、水溶性色素，此培养基选择性强，大肠埃希菌不能生长，革兰阳性菌生长较差。在缺乏十六烷基三甲基溴化铵琼脂时也可以用乙酰胺培养基进行分离，将菌液划线接种于平板上，置361培养1824小时。铜绿假单胞菌在此培养基上生长良好，菌落扁平，边缘不整，菌落周围培养基略带粉红色，其他菌不生长。（3）染色镜检：挑取可疑的菌落，涂片，革兰染色，镜检为革兰阴性者应进行氧化酶试验。（4）氧化酶试验：取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内，用无菌玻璃棒挑取铜绿假单胞菌可疑菌涂在滤纸片上，然后在其上滴加一滴新配制的1%二甲基对苯二胺试液，在1530秒钟之内，出现粉红色或紫红色时，为氧化酶试验阳性；若培养物不变色，为氧化酶试
14、验阴性。（5）绿脓菌素试验：取可疑菌落23个，分别接种在绿脓菌素测定培养基上，置361培养242小时，加入氯仿35mL，充分振荡使培养物中的绿脓菌素溶解于氯仿液内，待氯仿提取液呈蓝色时，用吸管将氯仿移到另一试管中加入1mol/L的盐酸1mL左右，振荡后，静置片刻。如上层盐酸液内出现粉红色到紫红色时为阳性，表示被检物中有绿脓菌素存在。（6）硝酸盐还原产气试验：挑取可疑的铜绿假单胞菌纯培养物，接种在硝酸盐胨水培养基中，置361培养242小时，观察结果。凡在硝酸盐胨水培养基内的小导管中有气体者，即为阳性，表明该菌能还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分解产生氮气。（7）明胶液化试验：取铜绿假单胞菌可疑菌落的纯培养物，穿刺接种在明胶培养基中，置361培养242小时，取出放冰箱1030分钟，如仍呈溶解状或表面溶解时即为明胶液化试验阳性；如凝固不溶者为阴性。（8）42生长试验：挑取可疑的铜绿假单胞菌纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，放在421培养箱中，培养2448小时，铜绿假单胞菌能生长，为阳性，而近似的荧光假单胞菌则不能生长。2、检验结果报告被检样品经增菌分离培养后，经证实为革兰阴性杆菌，氧化酶就绿脓菌素试验皆为阳性者，即可报告被检样品中检出铜绿假单胞
