色谱法理论基础

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1、第二章 色谱法的理论基础,1色谱流出曲线和色谱峰 2分配系数和分配比 3塔板理论 4速率理论 5分离度,分离原理和分配过程,分离原理：是利用混合物中各组分在流动相和固定相中具有不同的溶解和解析能力、吸附和脱附、排阻能力、亲和性能作用的差异，当两相做相对运动时，样品各组分在两相中反复多次（103106次）分配，从而使混合物中的组分得到分离。 组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。,描述色谱峰的参数： 1、峰高h（峰面积 A） 2、区域宽度： 、 Y1/2、 Yb Yb=1.699Y1/24 3、保留值： tR、tM、tR； VR、VM、VR (VN、Vg)； r

2、21,1 色谱流出曲线和色谱峰,备注,区域宽度和保留值各有3种表示方法。区域宽度中要注意这三种表示法之间的关系。 净保留体积（VN）：经压力修正的调整保留体积，VN=j VR , j：色谱柱进口压Pi和出口压P0间压力梯度校正系数。 比保留体积（Vg）：是把净保留体积进一步校正到单位质量固定液和273K时的保留体积。Vg=273/TcVN/g，g为固定液的重量。 最重要的是相对保留值r21。,相对保留值r21,相对保留值r21：组分2与组分1调整保留值之比。 r21也可用表示，也叫做分离因子。 r21 = tR2 / tR1= VR2 / VR1 =k2/k1=K2/K1=Vg2/Vg1,相对

3、保留值只与柱温和固定相性质有关，与其他色谱操作条件无关，它表示了固定相对这两种组分的选择性。故其可以作为一个定性指标。 注:重要的定性指标。只要与调整保留值有关的参数，都可以用于r21中。,2 分配系数和分配比,在一定温度、压力下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（单位：g/mL）比，称为分配系数，用K 表示，即：,在一定温度、压力下，组分在两相间分配达到平衡时的质量 比，称为分配比。分配比也称容量因子、容量比, 用k表示。,K=k,相比：,备注,一个是浓度比，一个是质量比，相差了一个体积比即相比。相比不同于K,k（固定相与流动相的浓度质量比），是流动相与固定相之间的体积比。 K，k是色谱分离

4、的依据。 K和k的关系：它们都是与组分及固定相的性质有关，也与柱温、柱压有关。但分配系数与两相体积无关，分配比与两相体积比有关； 在表征组分的分离行为时，分配系数与分配比都能说明组分与固定相之间作用力的大小，都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数，可以认为两者是等效的。K，k值越大，组分与固定相之间的作用力越大，保留时间越长。当K，k值为0时，表示组分与固定相之间不发生作用，不被溶解或吸附；分配系数难以测定，分配比可以由实验数据测得。,分配比与保留时间的关系,tR= tM(1+k),3 塔板理论,塔板理论假定： 1、在柱内一小段长度H内，组分可以在两相间迅速达到平衡。这一小段柱长称为理论塔板高度H

5、。 2、流动相（如载气）进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进气为一个塔板体积（Vm）。 3、所有组分开始时存在于第0号塔板上，而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略。 4、分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一塔板上的量无关。,备注,由于实际应用中常出现计算的板数很高，但色谱柱的实际分离效能并不高的情况，究其原因是保留时间tR(VR)包含了死时间tM(VM) ，而tM(VM)内并不参加色谱柱内的分配，只是流出色谱柱。随意为了准确评价色谱柱效能，提出以tR 代替tR计算得到的有效板数，采用neff和Heff。neff和Heff消除了死体积的影响，较为真实的反映了色谱柱的好坏。 塔板理论的特点：

6、柱长一定时，n越大，分配次数越多，柱效越高，峰越窄；不同物质测定出来的n不同，要说明测定的物质是什么；不能解释影响峰宽的因素（速率理论能解决的问题），不能解释多大柱效时二物质能分开（分离度的概念可以解决这个问题）。,4 速率理论提高柱效途径,H = A + B/u + Cu,塔板理论是一个半经验性的理论。它定性的给出了板高的概念，但不能指出影响板高的因素。速率理论(范弟姆特方程)就是在塔板理论的基础上，给出了影响塔板高度的因素：,气相色谱,(1)涡流扩散：引起涡流扩散的原因是色谱柱内的多路径。溶质分子在前进过程中形成的这种紊乱类似于涡流的流动，所以称之为涡流扩散。 A=2dp 空心毛细管柱无多

7、径相：A0,(2)纵向扩散：引起纵向扩散的原因是浓度梯度。纵向扩散是溶质分子在移动方向上向前和向后的扩散，引起谱带展宽。它是由浓度梯度所引起。纵向扩散引起的峰展宽由下式决定：,纵向扩散引起的色谱峰展宽示意图,式中B2Dg，为纵向扩散系数；为弯曲因子或阻碍因子，填充柱0.50.7，毛细管1；Dg为溶质在流动相中的扩散系数；u 为流动相线速度。随着样品带在固定相中的移动，因纵向扩散使样品带宽逐渐增加，相应得到的色谱峰就越来越宽而矮。,(3) 传质阻力引起的扩散 传质阻力系数C，是溶质在固定相中传质阻力系数(Cl)与流动相(气相)传质阻力系数(Cg)之和： CClCg 流动相传质阻力引起的扩散 溶质

8、分子要从流动相转移到固定相中，就要从流动相主体扩散到气液、气固、液液或液固界面，阻碍这一扩散过程的阻力称流动相传质阻力。流动相传质阻力引起的谱带展宽程度由下式决定：,(3) 传质阻力引起的扩散,固定相传质阻力引起的扩散 溶质分子到达两相界面后，将继续扩散到固定相内部达到分配平衡，然后又返回到两相界面。溶质在这一移动过程中的阻力称固定相传质阻力。固定相传质阻力引起的谱带展宽由下式决定：,H2dp+,影响H的因素： 填充柱均匀程度 填料颗粒大小dp 流动相种类Dg、流速u 固定液厚度df,提高柱效的途径： 填充要均匀 填料粒度小 流动分子量适中，最佳流速 减小固定液膜厚度,解释了同一色谱柱在不同的

9、载气流速下柱效n不同的实验结果， 指出了影响柱效n的因素及提高柱效的途径。,此式与GC范氏方程的形式是一致的，其主要区别在于分子扩散项可以忽略不计，影响板高的主要因素是传质阻力项Cu。为提高柱效采用以下方法: 采用粒度dp小而均匀 、孔穴小的担体(滞留流动相传质阻力小)和液膜 df薄的固定液作固定相。 Cu是主要因素时，采用低粘度溶剂（Dm大）作为流动相。 适当降低流动相速度u可以降低H。但流速太低会增大分子扩散项和减慢分析速度。 适当提高柱温，以降低流动相粘度，增大扩散系数Dm，可以减小传质阻力 ，但柱温过高，分子扩散加剧，Dm增大，柱效降低。液相色谱采用恒温操作，不能通过增加柱温显著改善传

10、质。载气流速增大，分子扩散项B/u的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项Cu的影响增大，又使柱效下降。选择最佳实验条件，才能使柱效达到最高。改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。,液相色谱,LC与GC的H-u曲线比较,1、LC的最佳流动相流速比GC要小得多，板高也小一些，这表明LC具有 更高的柱效。 2、LC的Hu曲线具有平稳的斜率，表明采用高的流动相流速时，色谱柱 柱效无明显损失，因此LC实际应用中可以采用高流速进行快速分析， 缩短分析时间。,5 分离度,分离度R：相邻两组分色谱峰保留值之差与两个组分色谱峰峰底宽度总和的一半的比值。,R=0.8：两峰有明显的重叠，两峰的分离程度可达

11、89%； R=1：分离程度98%，基本分离； R1.5：达99.7%（相邻两峰完全分离的评判标准）。,R与n、k的关系,解决了在什么样的柱效(n)下两物质能达到完全分离。,分离度的影响因素,k 影响峰位,n 影响峰宽窄,r21影响两峰间距,提高分离度的途径,（1）Rn 分离度与柱效的平方根成正比， r21一定时，增加柱效，可提高分离度。 （2）Rr21 增大r21是提高分离度的最有效方法。 增大r21的最有效方法是选择合适的固定液。,r21 1.01 1.10 1.20 1.30 1.40 1.50 1.60 2.0 r21 1 / r21 0.01 0.1 0.16 0.23 0.28 0.

12、33 0.38 0.5,k2 0.25 0.5 0.8 1.0 2 5.0 10 20 50 80 100 k2/（k2+1） 0.2 0.33 0.44 0.5 0.66 0.83 0.9 0.95 0.98 1,（3）R k2 增大k2可以提高R，但不是最佳途径（分析时间显著加长）。,备注,当相对保留值变化增大1倍时，R增加50倍；分配比变化40倍，R仅仅提高到5倍。所以增大r21是提高分离度的最有效方法。增大r21的最有效方法是选择合适的固定液。因为相对保留值只与柱温和固定相性质有关，与其他色谱操作条件无关，它表示了固定相对这两种组分的选择性。故其可以作为一个定性指标。,分析时间的估算,

13、在实际工作中，分析样品所需的时间比较重要，它大致等于最后一个样品离开色谱柱的时间。,例题与习题,1、假如一个溶质的分配比0.2，计算它在色谱柱流动相中的质量分数。 2、若在1m长的色谱柱上测得的两组分的分离度0.68，要使两者完全分离，则柱长至少应为多少米？ 3、组分A和B在某毛细管柱上的保留时间分别为14.6分和14.8分，理论塔板数对A和B均为4200，问： （1）组分A和B能分离到什么程度？ （2）假定A和B保留时间不变，而分离度要达到1.5，则需多少塔板数？ 4、在2m长的色谱柱上，测得某组分保留时间（tR）为6.6min，峰底宽（Y）为0.5min，死时间（tm）为1.2min，柱出

14、口用皂膜流量计测得载气体积流速（FrFc）为40 mL /min，固定相体积为（Vs）2.1 mL，求：（1）分配比k，（2）死体积 Vm，（3）调整保留体积 VR，（4）分配系数K，（5）有效塔板数neff，（6）有效塔板高度Heff（提示：流动相体积即为死体积）。 5、理论塔板数增加1倍，分离度增加几倍？若分离度提高1倍，柱长要增加几倍？分析时间要增加几倍？ 6、已知AB两组分在同一操作条件下的分配系数为45 和50，相比为30， 线速度为7cm/s，理论塔板高度为0.5mm，要使两者达到完全分离，分析时间为多少提示：（1达到完全分离时R=1.5；计算时k为第二组分的分配比）？,习题简答题

15、,1、组分保留时间为何不同？色谱峰为何变宽？ 2、什么叫死体积，如何测定死体积？ 3、色谱图上的色谱峰流出曲线可说明什么问题？ 4、在色谱流出曲线上，两峰间距离取决于相应两组分在两相间的分配系数还是扩散系数？为什么？ 5、某人制备了一根填充柱，用组分A和B为测试样，测得该柱理论塔板数为4500，因而推断A和B在该柱上一定能得到很好的分离，此推断正确吗？ 6、利用保留值定性的依据是什么？ 7、为什么用双柱或多柱定性？,习题简答题答案,1、组分保留时间为何不同？色谱峰为何变宽？ 组分保留时间：受色谱过程热力学因素控制，由组分和固定液的结构和性质 决定。 色谱峰变宽：受色谱过程的动力学因素控制，由两

16、相中的运动阻力，扩散决 定。 2、什么叫死体积，如何测定死体积？ 不被固定相吸附或溶解的组分，从进样开始到柱后出现最大值时所需要的 时间。通常对于热导检测器用空气作为测试样品； 对于氢火焰离子化检测 器，常用甲烷作为测试样品。 3、色谱图上的色谱峰流出曲线可说明什么问题？ 根据色谱峰的数目，可判断样品中所含组分的最少个数。 根据峰的保留值进行定性分析。 根据峰的面积或高度可以进行定量分析。 根据峰的保留值和区域宽度，判断色谱柱的分离效能。 根据两峰间距离，可评价固定相及流动相选择是否合适。,习题简答题答案,4、在色谱流出曲线上，两峰间距离取决于相应两组分在两相间的分配系数还是扩散系数？为什么？ 分配系数。色谱流出曲线上，两峰间距离由热力学性质决定，反映二物流出