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1、从”单一”组学到“多组学” 高通量项目设计不功能基因挖掘 张羽2014/9 yzhang 1 背景 2 数据 mRNA水平 目标基因 转录组测序 数 据 分 析 表达差异分析 基因表达趋势分析 共表达网络分析 . 背景 3 DNA信息 基因组de novo 测序 重测序 RAD测序 Meta测序 转录调控 ChIP-Seq MeDIP-Seq BS RRBS 小RNA测序 LncRNA测序 蛋白组研究 蛋白全谱分析 蛋白定量分析 蛋白修饰分析 目标蛋白分析 问题1：深入 问题2：串联 mRNA水平 目标基因 提 纲 1. 各个组学技术以及最新进展 2. 项目设计：从单组学到多组学 3. 分析方
2、法和图表呈现方法优化 4 不同组学水平的应用 DNA测序 基因组de novo测序 重测序 RAD测序 Meta测序 RNA测序 转录组测序 表达谱测序 小RNA测序 LncRNA测序 表观基因组研究 ChIP-Seq MeDIP-Seq BS RRBS 蛋白组研究 蛋白全谱分析 蛋白定量分析 蛋白修饰分析 目标蛋白分析 5 全基因组重测序全基因组重测序 6 RNA-seq分析流程 表达量研究 基于参考序列 转录本研究 从头组装参考基因组比对 表达聚类分析 基因网络构建 基因趋势分析TF-cluster分析 分子机理研究 时空特异富集分析 染色体富集分析 疾病预测模型构建公用数据关联 TF-g
3、ene-miRNA分 析 数据库构建 表达谱 转录组 7 小RNA信息分析内容 测序及序 列分类、 统计 比对注释 差异分析 GO、KEGG富集分析 靶基因预测靶基因预测 8 小RNA新分析内容 小RNA丌仅仅是miRNA 其他小RNA：siRNA，piRNA 小RNA作用丌仅仅是靶向沉默转录组本 小RNA介导组甲基化、蛋白修饰 9 10 RNA 干扰； DNA 甲基化； 组蛋白修饰以及蛋白 DNA互作； 表观遗传调控 ChIP-Seq 11 CHIP + Seq Chromatin immunoprecipitation和高通量测 序的结合 全基因组范围内研究蛋白与DNA的相互作 用机制 高
4、性价比,抗体富集后仅需较少的数据量 规模即可鉴定全基因组范围内的结合位点 12 DNA methylation - MeDIP-Seq 基于富集原理，高性价比 在高CpGCpG密度，高DNADNA甲基化水平区域具有 很好的抗体亲合性 尤适用于大样本量的表观研究 MeDIp/CHIP-Seq分析流程 原始数据 数据清理 序列比对 Peak 扫描 Peak相关基因 Peak 分布 Genome Browser可视化 GO功能分析 多个样品的差异分析多个样品的差异分析 Peak 区域 13 14 Whole genome BS Whole genome BS and RRBSand RRBS（亚硫酸
5、盐处理）（亚硫酸盐处理） Msp I: 酶切位点CCGG 15 Whole- genome BS RRBSMeDIP-seqCHIP-seq 覆盖范围全基因组范围 酶切位点的 区域 高甲基化、 高CpG密度 区域 对应蛋白修饰 的区域 精度 单碱基（区分 三种motif) 单碱基(区分 三种motif) 约100bp约100bp 推荐数据 量 基因组大小 30x， 至少20x 48G 1-4G，视具 体物种不同 1-4G，视具体 物种不同 适用范围 获得全基因组 高分辨率甲基 化图谱 相对甲基化 差异的比较， 适于大样本 量研究 相对甲基化 差异的比较， 适于大样本 量研究 蛋白DNA互作 （
6、或多样本差 异比较） 四种技术四种技术 16 表观遗传不仅仅是表观遗传不仅仅是C或或CpG DNA甲基化位点三种不同的motif类型（CG，CHG，CHH）， 在个体内的调控机理和功能并不相同。 CHH岛：在编码基因上游的CHH高甲 基化，可能用于隔离编码基因和转座子 Jonathan G，Genome Res. 2013 23: 628-637Michael R， Genome Res. 2013 23: 1651-1662 CHG的甲基化，可能会影响可变剪切。 iTRAQ蛋白定量技术路线 （多样本同时进入质谱仪） 蛋白质组学相关技术 17 鉴定蛋白数鉴定蛋白数 定量准确性定量准确性 实验复
7、杂实验复杂 度度 可比较可比较 样品数样品数 完成周期完成周期 iTRAQ（标（标 记）记） 一般一般好好复杂复杂一次一次8个个短短 Label-free 更多更多一般一般简单简单很多很多长长 蛋白定量分析蛋白定量分析Label-free VS. iTRAQ 服务内容 18 蛋白质谱技术逐步成熟 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 200920102011201220132014 蛋白质谱文章检索 检索词： (Proteome) OR （Proteomics）) AND (mass spectrum) 0 50 100 150 200 250 300 200
8、920102011201220132014 转录组和蛋白贯穿文章检索 检索词：(transcriptomeTitle/Abstract) OR transcriptTitle/Abstract) AND (proteomeTitle/Abstract) OR proteomicsTitle/Abstract) 备注：检索数据均来自Pubmed(2014.9.04) 蛋白组文章数趋于稳定蛋白组贯穿类文章逐年增加 19 提 纲 1. 各个组学技术以及最新进展 2. 项目设计：从单组学到多组学 3. 分析方法和图表呈现方法优化 20 单组学设计RNA-seq 对照处理 梯度处理 处理处理样本关系样本
9、关系 不同品系 不同近缘 种 病原宿主 21 设置重复 RNA-seq: 差异表达分析 两两差异分析的不足：两两差异分析的不足： 片面：无法呈现基因动态 变化过程； 背景干扰：基因的随机波 动 策略策略：同时对多点进行分析 （例如：基因表达趋势分析） 22 处理前5h 10h A1 ，A2B1 ，B2C1 ，C2 de novo 转录组 所有样本原 始数据 所有样本基 因表达量 确定样本 关系 差异基因集 参考序列 比对 PCA分析差异分析 有潜在生物学意 义的趋势 趋势分析 确定目标基因集 功能富集分析 趋势分析设计思路 后续实验室验证 23 组装 定量 表达模式 精细挖掘 超氧化物对荔枝转
10、录组调控的影响 消除背景噪音，减 少目标基因数量 多点检测，结果更 具生物学意义 24 ABA信号转导相关的基因表达量普遍上调 RNA-seq: 处理 + 品系 + 重复 研究目的：珊瑚的高温适应性分子机理 材料处理 备注：每个组都设置了生物学重复 研究方法：RNA-seq 普通品种（A1）耐高温品种（A2） 常温处理（B1）A1B1A2B1 高温处理（B2）A1B2A2B2 25 Daniel B,PNAS ,2013, 4: 13871392 处理 + 品系 + 重复 1）对照-高温 差异分析 2）两个品种差异基因对比（维恩图） 3）目标基因（Hsp70, zinc metalloprot
11、eases等）在耐高温 品种提前储备、应激反应更小。 26 普通品种的差异倍数 高 温 品 种 的 倍 数 普通耐高温 高温 处理 常温 处理 品系 表达量 单组学设计的后续 广度 增加取样时间节点 分析更多类型的材料 深度 生物学验证 增加其他组学的解释 27 多组学的设计 RNA-seq数据 DNA测序 ChIP-seq 甲基化修饰 蛋白组数据 小RNA 转录因子 28 表达量 相关性 A组学差异 基因 验证 两组学贯穿的一般思路 潜在调控关系 B组学差异 基因 序列靶 向关系 已报道 的关系 分类和统计 29 Young（6 month)Aging（24 month） 小RNA测序A1（
12、6只混合）A2（6只混合） RNA-SeqB2（5只混合）B2（5只混合） miRNA-mRNA调控贯穿 小鼠肌肉衰老机制研究 实验设计： Ji Young K，AGING 2014, Vol. 6 No. 730 贯穿分析 确定调控关系： 1）序列靶向关系； 2）表达量负相关； miRNA-靶基因关系网络 31 贯穿减少候选基因数量 32 以基迪奥完成的一个项目为例（三个样本，RNAseq+小RNA） 贯穿分析前的 数量 贯穿分析后的 数量 贯穿后/贯穿前 目标miRNA数 量 2202812.7% 每个miRNA平 均靶基因数量 1125 94340 373.6% miRNA-TF-mRN
13、A调控网络 33 TF miRNA mRNA Grace T. Huang, Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39 设计：6例野生型细胞，6例耐药型细胞（相对为小样本） 目的：寻找耐药因子 策略： 1）小RNA测序 + mRNA测序 2）miRNA-TF-mRNA 贯穿分析 34 Lotte H,SCIENTIFIC REPORTS , 4 : 5260 贯穿网络构建与比较 发现基因PHF6在抗 性株中特异受调控， 为潜在抗性因子 后续使用qPCR， western blotting， knockdown来验证 功能 小结： 小样本构建网络也能 找到潜在有
14、价值的信 息； 35 野生型网络 抗性株网络抗性株网络 基迪奥相似案例 猪骨骼肌发育相关调控网络（TF- miRNA gene） 36 我们使用类似的策 略，研究两个地方 猪种骨骼肌发育调 控机制差异。 基迪奥三组学贯穿案例 基因组印记研究 材料：蓖麻杂交种子（F1） 目的：寻找基因组现象以及来源 基因表达：等位基因表达谱的亲源效应（母源 表达不父源表达的差异）； 甲基化修饰：种子甲基化差异以及甲基化的亲 源效应； 分析差异表达不差异甲基化的关系； 37 W xu, Nucleic Acids Res 2014 5;42(11) 利用SNP区分不同亲源reads AT 亲本序列以 及差异 F1
15、序列以及对 应reads的亲本 来源判断 A T 比对 38 重测序、转录组、甲基化测序贯穿 种子胚乳转录 组测序 种子胚和胚乳 Bisulfite测序 父母本重测序 亲本间差异 SNP 父源不母源 等位基因表 达差异 父源不母源等 位基因甲基化 差异 区分父源reads 和母源reads 分析差异表达和差异 甲基化的关联性 胚不胚乳甲基 化差异 39 分析差异表达和差异甲基化的关联性 目标基因在胚乳中表达量上调，其启劢子区甲基化率下调 胚乳母源等位基因（印记基因）表达量上调，对应其母源等位基因甲基化率下调 40 蓖麻项目待解决的问题 留下思考的问题： 1）子代甲基化状态是否遗传自亲本？ 解决
16、方案：亲本甲基化测序； 2）种子在丌同发育阶段的甲基化是否发生变化，如何受到其他组 学的调控（例如，RdDM） 解决方案：增加时间点 + 小RNA测序 + 贯穿 3）蓖麻的甲基化调控有什么特点，是类似玉米（含大量转座子） or 拟南芥？ 解决方案：多组学贯穿 + 比较基因组 4） 41 miRNA-甲基化-转录组 设计思路： 42 三种组学分别定量 特定区域或类型分 类统计 表观：三种motif分类（CHH，CHG，CG） 小RNA：不同长度的siRNA mRNA：不同表达丰度 不同基因组区域：TE，基因区，基因上下游 关联并推导规律 典型基因讨论 材料特点：受精前的玉米穗外层， 细胞形态多样，处于甲基化调控活 跃期。 测序策略：全基因组BS、表达谱、 小RNA 研究目的： 1）siRNA对甲基化的调控方式； 2）CHH在转录组调控中的作用； 43 J
