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1、第二篇 酶的结构与功能（第五十章 小结）第五章 酶学概论酶是由细胞合成的，在机体内行使催化功能的生物催化剂，其化学本质主要是蛋白质，极少数是RNA。具有催化活性的RNA被称为核酶。酶可分为单纯酶和缀合酶。缀合酶除了蛋白质以外，还结合某些对热稳定的非蛋白质小分子或金属离子。这些非蛋白质成分统称为辅助因子。丧失辅助因子的酶被称为脱辅酶，与辅助因子结合在一起的酶被称为全酶。辅助因子包括辅酶、辅基和金属离子。许多辅酶和辅基为水溶性维生素的衍生物。最常见的充当辅助因子的金属离子有铜、镁和锰。根据酶蛋白本身结构的特征，酶可分为单体酶、寡聚酶和多酶复合物。单体酶中有一类多功能酶，只由一条肽链组成，但同时具有
2、多个酶的活性。受酶催化的化学反应被称为酶促反应，其中的反应物被称为底物。酶只能催化热力学允许的反应，反应完成后本身不被消耗或变化，对正反应和逆反应的催化作用相同，不改变平衡常数，只加快到达平衡的速度或缩短到达平衡的时间，这些性质与非酶催化剂相似。酶特有的性质包括：高效性、酶在活性中心与底物结合、专一性、反应条件温和、对反应条件敏感、受到调控和许多酶的活性还需要辅助因子的存在。酶的活性中心是指酶分子上直接与底物结合，并与催化作用直接相关的区域。活性中心由结合基团和催化基团组成。活性中心具有以下特征：是一个三维实体，通常由在一级结构上并不相邻的氨基酸残基组成；为酶分子表面的一个裂缝、空隙或口袋，中
3、心内多为疏水氨基酸残基，但也有少量极性氨基酸残基。有65%以上的酶活性中心的催化基团由His、Cys、Asp、Arg、Glu提供；与底物结合为多重次级键；底物结合的特异性取决于与底物之间在结构上一定程度的互补性；构象具有一定的柔性。酶的专一性是指酶对反应的底物有严格的选择性。专一性可分为绝对专一性、基团专一性、键专一性和立体专一性。立体专一性又分为旋光异构专一性和几何异构专一性两类。酶的立体异构专一性还表现在能够区分假手性C上的两个等同的基团，只催化其中的一个，而不催化另一个。可使用“锁与钥匙”学说和“诱导契合”学说解释酶作用的专一性。“锁与钥匙”学说把酶比作锁，底物比作钥匙，锁眼比作活性中心
4、，认为酶活性中心的构象是固定不变的，底物的结构必须与酶活性中心的结构非常吻合才能结合。“诱导契合”学说认为酶活性中心不是僵硬不变的结构，而是具有一定的柔性。当底物与酶接近时，酶受到底物分子的诱导，其构象发生适合于与底物结合的变化，最终导致酶与底物之间的契合。可使用“三点附着”模型和“四点定位”模型解释酶为什么能够区分对映异构体以及一个假手性C上两个一样的基团。“三点附着”模型认为，底物在活性中心的结合有三个结合点，只有当在这三个结合点都匹配的时候，酶才会催化相应的反应；“四点定位”模型认为，仅仅三点附着还不足以让一个蛋白质区分进入的对映异构体，活性中心存在第四个相互作用位点。酶的分类是按照NC
5、-IUBMB的建议，根据反应的性质，可分为氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、连接酶6大类。在每一大类酶中，又可根据不同的标准，分为几个亚类，每一个亚类再分为几个亚亚类。酶的命名也是根据NC-IUBMB 的建议，每一个酶都给一个系统名和一个惯用名。第六章 酶动力学酶反应速率一般以单位时间内，底物或产物浓度的变化值来表示。酶动力学研究的是酶促反应速率、变化规律及其影响因素。影响酶促反应速率的主要因素有酶浓度、底物浓度、反应温度、pH和离子强度以及有无抑制剂或激活剂的存在等。在研究某一种因素对酶促反应速率的影响时，应该只改变需要研究的因素。在一定的温度和pH条件下，当底物浓度过量时，酶的浓
6、度与反应速率呈正相关。但温度升高如果导致酶变性，酶活性会急剧下降。反应速率最大时的温度称为酶的最适温度。酶的最适温度不是酶的特征性常数，这是因为它与反应时间有关；pH不仅可影响酶的稳定性，还可影响酶分子或底物和辅酶/辅基的解离程度，从而影响酶与底物的结合。酶也有最适pH，最适pH也不是酶的特征性常数，它受底物浓度、缓冲液的种类和浓度以及酶的纯度等因素的影响。酶动力学研究的核心内容是底物浓度对酶促反应速率的影响以及为解释这种影响而推导出来的数学方程。常假定反应为单底物和单产物反应。很多酶促反应如果以反应速率对底物浓度作图，得到的是双曲线。解释这一类反应可使用M-M模型，根据此模型推导出的方程为米
7、氏方程。米氏反应动力学假定反应速率为初速率、酶底物复合物处于稳态和符合质量作用定律。米氏方程中的Km即是米氏常数，它是酶反应初速率为Vmax一半时底物的浓度，为酶的特征常数，在一定条件下，可表示酶与底物的亲和力。一个酶的Km越大，意味着该酶与底物的亲和力越低；Vmax也是酶的特征常数，但在现实的条件下，一个酶促反应很难达到或者根本就达不到此值。kcat 给出了酶被底物饱和以后，酶催化产物的生成情况，有时被称为酶的转化数，具体是指在单位时间内，一个酶分子将底物转变成产物的分子总数；kcat/Km通常被用来衡量酶的催化效率，可以反映一个酶的完美程度。直接使用米氏方程中的v 对S作图得到的是曲线，需
8、要将米氏方程进行线性化处理。米氏方程的线性转换方法有：Lineweaver-Burk作图、Eadie-Hofstee作图、Hanes-Wolff作图和直接线性化作图。Lineweaver-Burk作图以1/S为横坐标和1/v为纵坐标作图，因此又称为双倒数作图。此作图法得到的斜率是Km/Vmax，横截距是-1/Km，纵截距为1/Vmax；以v对v/S作图即是Eadie-Hofstee作图。此作图法得到的斜率是-Km，横截距是Vmax/Km，纵截距为Vmax；以S为横坐标，S/v为纵坐标的作图方式即是Hanes-Wolff作图。此作图法得到的斜率是1/Vmax，横截距是-Km，纵截距为Km/Vma
9、x。相比双倒数法和Eadie-Hofstee 作图法，Hanes-Wolff作图为最佳的确定酶动力学常数的方法。酶分子变性或抑制剂的作用可导致酶活性的降低或丧失。抑制剂能够以不同的方式作用于酶，而酶动力学是区分各种作用方式的主要手段。酶的抑制剂可分为可逆性抑制剂和不可逆性抑制剂。可逆性抑制剂以次级键与酶可逆性结合，这些键形成得快，断裂得也快，它们并不能永久性使酶失活，使用透析或超滤就可除去，使酶恢复活性；不可逆性抑制剂以强的化学键与酶不可逆结合，导致酶有效浓度的降低，因此一旦失活就不可逆转。可逆性抑制剂又可分为竞争性抑制剂、非竞争性抑制剂和反竞争性抑制剂。竞争性抑制剂有两种类型：一类与底物在结
10、构和化学性质上具有很强的相似性，第二类与底物无结构和化学性质的相似性。它们与底物在和酶结合上都是相互排斥的。竞争性抑制剂不改变Vmax，但能提高表观Km。非竞争性抑制剂在活性中心以外与酶结合并改变活性中心的构象，但不阻止底物在活性中心与酶结合，只阻止底物转变成产物。典型的非竞争性抑制剂不改变酶的Km，降低Vmax。反竞争性抑制剂是一类只能与酶和底物复合物ES结合，但不能与游离的酶结合的抑制剂。一旦它们与ES结合，将导致与活性中心结合的底物不再能够转变为产物。反竞争性抑制剂能降低酶的表观Km，降低Vmax。很多情况下，产物能够抑制酶促反应。在单底物反应中，产物实际上是一种特殊的竞争性抑制剂。多底
11、物反应情况更为复杂，通常底物浓度的升高加快酶促反应的速率，但是某些酶却表现出过量底物抑制现象。不可逆抑制剂可分为基团特异性抑制剂、底物类似物和自杀型抑制剂。基团特异性抑制剂在结构上与底物无相似之处，但能共价修饰酶活性中心上的必需侧链基团而导致酶活性不可逆的失活；底物类似物在结构上与底物相似，因此在活性中心与酶结合，然后不可逆地修饰酶活性中心上的必需基团，导致酶活性的丧失；自杀型抑制剂是受酶自身激活的不可逆抑制剂，在与酶结合以后，受到酶的催化发生几步反应，但并不形成产物，而是变成高度反应性的化合物后，转而修饰酶的必需基团导致酶活性的丧失。现实中更多的是双底物/双产物反应和三底物/三产物反应，偶尔
12、还有四底物反应。在研究多底物反应中，只要将其中一种底物以外的所有其他底物的浓度保持恒定，对剩下的浓度可变底物的动力学分析就相当于单底物反应。一般而言，多底物反应动力学机制可以分为序列机制和乒乓机制。序列反应是指在第一个产物释放之前所有的底物必须与酶活性中心结合的反应，可以进一步分为有序反应和随机反应。有序序列反应中，底物与酶的结合和产物从酶的释放都有严格的次序。在随机序列反应中，底物与酶的结合无固定的次序，产物的释放也一样。底物结合的次序和产物释放的次序无关紧要，说明每一个底物的结合位点或每一个产物的结合位点基本上是彼此相互独立的。乒乓反应在第二个底物结合之前必须有一个产物释放。使用Clela
13、nd作图法能清楚地反映出多底物反应中底物结合和产物释放的先后关系。除米氏酶以外，生物体内还有别构酶。别构酶除了含有活性中心以外，还有别构中心。别构中心是底物以外的分子结合的位点，这些分子被统称为别构效应物。一种典型的别构酶具有以下性质：速率/底物浓度曲线为S型、对竞争性抑制的作用表现双相反应；温和变性可导致别构效应的丧失；通常由多个亚基组成。使用Hill方程能很好地说明别构酶的动力学，Hill方程与米氏方程的主要差别首先是Hill方程中的底物浓度被提高到h 数量级，h 被称为Hill系数；其次，方程中以K0.5取代Km，该常数也被提高了h数量级。K0.5也是指速率为最大速率一半时候的底物浓度。
14、Hill常数能够反映底物协同性的程度：h=1，意味着酶不是别构酶，无底物协同性，速率对底物作图应为双曲线，K0.5=Km；h1，则速率对底物浓度作图呈S型曲线，酶具有正底物协同性；h1，则意味着酶具负底物协同性。正协同效应意味着酶对环境中底物浓度的变化更为敏感。第七章 酶的催化机制和催化策略酶高效的催化能力与酶的催化机制密切相关。可通过找出保守性的氨基酸残基、研究三维结构、定点突变、动力学分析和化学修饰等方法来研究酶的催化机制。在任何一个化学反应体系中，反应物需要到达过渡态以后才能发生反应。达到过渡态要求反应物必须含有足够的能量以克服活化能，然而，一个反应系统中各反应物分子具有不同的能量，只有
15、某些反应物才含有足够的能量去进行反应。Pauling 提出，酶与过渡态的亲和力要比对处于基态底物的亲和力高得多，酶的催化源于其对过渡态的稳定作用。实际上，酶将反应分成若干步，因其与反应过渡态中间物的结合比和底物的结合更牢、更好而稳定反应的过渡态，从而减低活化能，加快反应速率。与酶催化相关联的过渡态稳定是酶活性中心结构和反应性以及结构性质与结合底物之间的相互作用的必然结果。酶充分使用一系列的化学机制来实现过渡态的稳定并由此加速反应。这些机制归纳起来主要有邻近定向效应、广义的酸碱催化、静电催化、金属催化、共价催化和底物形变。邻近定向效应是指两种或两种以上的底物同时结合在酶活性中心上而相互靠近，并采
16、取正确的空间取向，这样就大大提高了底物的有效浓度，使分子间反应近似分子内反应从而加快了反应速率。广义的酸碱催化是指水分子以外的分子作为质子供体或受体参与的催化。活性中心电荷的分布可用来稳定酶促反应的过渡态，酶使用自身带电基团去中和一个反应过渡态形成时产生的相反电荷而进行的催化称为静电催化。金属离子参与的催化被称为金属催化。金属离子以5种方式参与催化： 作为Lewis酸接受电子，使亲核基团或亲核分子的亲核性更强； 与底物结合，促进底物在反应中正确定向； 作为亲电催化剂，稳定过渡态中间物上的电荷； 通过价态的可逆变化，作为电子受体或电子供体参与氧化还原反应； 酶结构的一部分。共价催化的酶在催化过程中必须与底物上的某些基团暂时形成不稳定的共价中间物。许多氨基酸残基的侧链和一些辅酶或辅基可作为共价催化剂。共价中间物的形成将反应系统带向过渡态，有利于克服活化能。形成酶与底物共价中间物的手段主要是亲核催化，也有亲
