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1、实验报告课程名称：环境微生物学 学 院：资环学院 专 业： 姓 名：邓丁 学 号： 年 级： 任课教师：钱晓莉 2014年 05月 22日实验一 光学显微镜的使用及原核微生物、真核微生物的观察一、实验目的（1）了解普通光学显微镜的构造及原理，掌握显微镜的操作及保养方法。（2） 观察、识别几种原核微生物。真核微生物的个体形态，学会生物图的绘制。二、实验器皿与材料（1）器皿：显微镜、擦镜纸、二甲苯。（2）材料：示范片：细菌三形（球状、杆状、螺旋状）、弧状（硫酸盐还原菌）、丝状（浮游球衣菌等）、细菌鞭毛及细菌荚膜。放线菌、颤蓝细菌、微囊蓝细菌或念珠蓝细菌等。三、实验步骤（1）将标本片放在载物台上，使
2、观察的目的物置于圆孔正中央。（2）将镜头换成低倍镜，将粗调节器向下旋转（或载物台向上旋转），眼睛注视物镜。当物镜的尖端距离载玻片约0.5cm处时停止旋转。（3）左眼对着目镜观察，将粗调节器向上旋转，如果见到目的物，但不十分清楚，可用细调节器调节，直至目的物清晰。此时找到目的物并移至中央。（4）换成高倍镜，观察目的物，旋转细调节钮，直至视野清晰。（5）观察示范片，绘出其形态图。四、思考题（1）使用油镜时，为什么要先用低倍镜观察？答：为了找到目的物并移动到中央。（2）要使视野明亮，除采用光源外，还可采取哪些措施？ 答：调大孔径光阑，调整光源。如果是用反光镜的显微镜，用凹面镜可使视野明亮。五、生物图
3、实验二、微生物培养基的配制与灭菌一、实验目的（1）熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备工作。（2）了解配置微生物培养基的基本原理，掌握配置、分装培养基的方法。（3）学会各类物品的包装、配置（稀释水等）和灭菌技术。二、实验器皿与材料（1）实验器皿：高压蒸汽灭菌器、干燥箱、煤气灯、培养皿、试管、刻度移液管、锥形瓶、烧杯、两桶、药物天平、玻璃棒、玻璃珠、石棉网、药匙、铁架、表面皿、pH试纸和棉花等。（2）材料：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、NaOH和琼脂等。三、实验原理 培养基是微生物生长的基质，是按照微生物营养、生长繁殖的需要，由碳、氢、氧、氮、磷、硫、钾、钠、钙、镁、铁及微量元素和水，按一定的体积分数配
4、置而成。调整合适的pH，经高温灭菌后以备培养微生物之用。 由于微生物种类及代谢类型的多样性，因而培养基种类也多，它们的配方及配制方法也各有差异，但一般的配制过程大致相同。四、实验步骤1、取100mL蒸馏水倒入锥形瓶；2、称取牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g，琼脂 20g；3、用100g/L NaOH调节pH至7.27.4；4、盖上棉塞，121下灭菌1520min。五、思考题1、固体培养基加琼脂后加热溶化时要注意哪些问题？答：（1）加热器功率不能太高，也不能太低。太高，容易沸腾和把培养基烧焦；太低，培养基容易凝固。（2）受热要均匀，可以垫上石棉网，要用玻璃棒不停缓慢搅拌。（3）
5、加热完毕后，要在合适的温度（60左右）倒平板，防止凝固。2、培养基中加琼脂的作用是什么？答：琼脂的作用就是让培养基凝固。3、如何检查培养基灭菌是否彻底？答：将灭菌后的培养基按灭菌锅内不同位置,每处抽取数管标号,置25至30摄氏度培养一周左右进行检查,若培养基无什么变化说明灭菌效果较好实验三、细菌的革兰氏染色一、实验目的 （1）了解细菌的涂片及染色在微生物学实验中的重要性。 （2）学会细菌染色的基本操作技术，从而掌握微生物的一般染色法和革兰氏染色法。二、染色原理 微生物细胞由蛋白质、核酸等两性电解质及其他化合物组成。所以，微生物表现出两性电解质的性质。两性电解质兼有碱性基和酸性基，在酸性溶液中解
6、离出碱性基，呈碱性带正电；在碱性溶液中解离出酸性基，呈酸性带负电。经测定，细菌等电点（pI）在25之间时，大多以两性离子存在，当细菌在中性、碱性或偏酸性溶液中时，细菌带负电荷，所以容易与带正电荷的碱性染料结合，故用碱性染料染色的为多。 微生物体内各结构与染料结合力不同，故可用各染料分别染微生物的各结构以便观察。三、实验器皿、试剂、材料 （1）器皿：显微镜、接种环、载玻片、酒精灯。 （2）试剂：草酸铵结晶紫染液、革兰氏碘液、体积分数为95%的乙醇、质量浓度为5g/L的沙黄染色液等。 （3）材料：枯草杆菌、大肠杆菌。四、实验步骤（1）涂片：载玻片 滴一滴蒸馏水 蘸菌染匀 自然干燥（2）初染：用草酸
7、铵结晶紫染液染色12min后水洗（3）媒染：用革兰氏碘液染色12min后水洗（4）脱色：滴加体积分数为95%的乙醇，约45 s后水洗（5）复染：滴加番红染色23min后水洗并干燥（6）镜检：用显微镜观察菌体形态五、思考题（1）要得到正确的革兰氏染色结果必须注意哪些操作？关键在哪几步？为什么？答：应注意干燥时不要用火烧太久。关键在于涂片，涂片的时候要注意涂均匀，并且两个菌的量也要差不多，否则太厚的地方脱色就不均匀了。实验四、总大肠菌群的检验一、实验目的（1）了解总大肠菌群的数量指标在环境领悟的重要性，学会总大肠菌群的检验方法。（2）通过检验过程，了解大肠菌群的生化特征。二、基本原理和方法（1）人
8、的肠道中主要存在3大类细菌：大肠菌群；肠球菌；产气荚膜杆菌。由于大肠菌群的数量大，在体外存货时间与肠道致病菌相似，且检验方法比较简便，故被定为检验肠道致病菌的指示菌。（2）总大肠菌群包括肠杆菌科中的埃希氏菌属、柠檬酸细菌属、克雷伯氏菌属、肠杆菌属。这四属菌都是兼性厌氧、无芽孢的革兰氏阴性杆菌。大肠杆菌的检测方法主要有多管发酵法和滤膜法。三、仪器和材料（一）器皿显微镜、锥形瓶（500mL）1个、试管6或7支、大试管（150mL）2支、移液管1mL 2支 10mL 1支、培养皿10套、接种环、试管架1个。（二）试剂、材料（1）革兰氏染色液一套（2）受污染的河水400mL （3）化学药品：蛋白胨、乳
9、糖、磷酸氢二钾、琼脂、无水亚硫酸钠、牛肉膏、氯化钠、质量浓度16g/L的溴甲酚紫乙醇溶液、质量浓度50g/L的碱性品红乙醇溶液、质量浓度20g/L伊水红溶液、质量浓度5g/L亚甲蓝水溶液。（4）其他：质量浓度100g/L NaOH、体积分数10% HCl、精密pH试纸（6.48.4）等。四、步骤（1）初发酵试验：在2个各装有已灭菌50ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液（4.2）的大试管或烧瓶中（内有倒管）内，以无菌操作各加入水样100ml；在10支装有已灭菌5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），以无菌操作各加入水样10ml，混匀后置于37恒温箱内培养24h。（2）平板分离：经培养24h
10、后，将产酸产气及只产酸的发酵管，分别接种于品红亚硫酸钠培养基或伊红美蓝培养基上，再置于37恒温箱内培养1824h，挑选符合下列特征的菌落，取菌落的一小部分进行涂片、革兰氏试验、镜检。（3）复发酵试验：上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽胞杆菌，则挑取该菌落的另一部分再接种于普通浓度乳糖蛋白胨培养液中（内有倒管），每管可接种分离自同一初发酵管的最典型的菌落13个，然后置于37恒温箱中培养24h，有产酸产气者（不论倒管内气体多少皆作为产气论），即证实有总大肠菌群存在。五、思考题（1）测定总大肠菌群数的意义是什么？答：判断水体是否受粪便污染（2）粪大肠菌群与总大肠菌群有何异同？答：两者差别在于大肠菌类微生物可能来自于一般环境, 无法完全判定是受到粪便污染的指标。 而粪大肠菌群是比较能够代表遭受粪便污染。严格执行现金管理制度和现金使用范围，遵守银行结算制度，现金银行存款按时间顺序逐笔登记，每日结出余额现金当日核对，银行存款月终必须与银行核对，做到日清月结。
