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1、一、试验原理几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所用条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并尽可能减少其相互间的聚集。最常用的方法是将强阴离子去污剂 SDS 与某一还原剂并用，并通过加热使蛋白质解离后再加样于电泳凝胶上。变性的多肽与 SDS 结合并因此而带负电荷，由于多肽结合 SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此 SDS 多肽复合物在聚丙烯酰凝胶电泳中的迁移只与多肽的大小相关。在达到饱和的状态下，每克多肽约可结合 1.4 克去污剂，借助已知分子量的标准参照物，则可测算出多肽链的分子量。SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳大多在不连续缓冲系统中进行，其电泳槽缓冲液的 pH
2、值与离子强度不同于配胶缓冲液，当两电极间接通电流后，凝胶中形成移动界面，并带动加入凝胶的样品中所含的 SDS 多肽复合物向前推进。样品通过高度多孔性的积层胶后，复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带（或称积层）。曲于不连续缓冲系统具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力，故大大提高了 SDS 聚丙烯酰胺凝胶的分辨率。样品和积层胶中含 Tris-Cl(pH6.8)，上下槽缓冲液含 Tris-甘氨酸(pH8.3)，分离胶中含 Tris-Cl(pH8.8)的。系统中所有组分都含有 0.1%SDS(Laemmli,1970)，样品和积层胶中的氯离干形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界，
3、在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域，它推动样品中的多肽前移并在分离胶前沿积聚，此处 pH 值较高，有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的多肽并紧随氯离子之后，沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后，SDS 多肽复合物成一电位和 pH 值均匀的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。丙烯酰胺凝胶电泳通常用来查看蛋白混合物样品的复杂程度和监测纯化效果。这种方法分离效果极好，可惜很难在不丧失精度情况下放大到制备规模，因为随着胶厚度的增加，电泳时的热效应会严重干扰蛋白的泳动。Western bloting 首先是要将电泳后分离的蛋白从凝胶中转移到 NC 膜上，通常
4、有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。毛细管印迹法是将凝胶放在缓冲液浸湿的滤纸上，在凝胶上放一片 NC 膜，再在上面放一层滤纸等吸水物质并用重物压好，缓冲液就会通过毛细作用流过凝胶。缓冲液通过凝胶时会将蛋白质带到 NC 膜上，NC 膜可以与蛋白质通过疏水作用产生不可逆的结合。但是这种方法转移效率低，通常只能转移凝胶中的一小部分蛋白质（10%-20%）。而电泳印迹可以更快速有效的进行转移。这种方法是用有孔的塑料和有机玻璃板将凝胶和 NC 膜夹成“三明治”形状，而后浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳方向就可以使蛋白质在电场力的作用下离开凝胶结合到 NC膜上。常用的电泳转移方法有
5、湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。湿转是一种传统方法，将胶/膜叠层浸入缓冲液槽然后加电压。这是一种有效方法但比较慢，需要大体积缓冲液且只能用一种缓冲液。半干转移，用浸透缓冲液的多层滤纸代替缓冲液槽。与湿转相比，这种方法要快（15-45 分钟）。转移后的 NC 膜就称为一个印迹（blot）,用于对蛋白质的进一步检测。印迹首先用蛋白溶液（如 10%的 BSA 或脱脂奶粉溶液）处理以封闭 NC 膜上剩余的疏水结合位点，而后用所要研究的蛋白质的抗体（一抗）处理，印迹中只有待研究的蛋白质与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，而其它的蛋白质不能与一抗结合，这样清
6、洗除去未结合的一抗后，印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠 IgG 的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。目前有结合各种标记物的抗体特定 IgG 的抗体（二抗）可以直接购买，最常用的一种是酶连的二抗，印迹用酶连二抗处理后，再用适当的底物溶液处理，当酶催化底物生成有颜色的产物时，就会产生可见的区带，指示所要研究的蛋白质位置。在酶连抗体中使用的酶通常是碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化物酶（HRP）。碱性磷酸酶可以将无色的底物 5-溴-4
7、-氯吲哚磷酸盐（BCIP）转化为蓝色的产物；而辣根过氧化物酶可以将 H2O2 为底物，将 3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色产物或将 4-氯萘酚氧化成蓝色产物。另一种检测辣根过氧化物酶的方法是用增强化学发光法，辣根过氧化物酶在 H2O2 存在下，氧化化学发光物质鲁米诺并发光，通过将印迹放在照相底片上感光就可以检测出辣根过氧化物酶的存在，即目标蛋白质的存在了。除了使用抗体或蛋白作为检测特定蛋白的探针以外，有时也使用其它探针如放射性标记的 DNA，可以检测印迹中的 DNA 结合蛋白。在 Western bloting 实验中，有另一种方法，就是直接标记一抗，再用底物显色。这种方法叫直接法，与用二抗的
8、间接法相比有诸多不足，标记二抗可用于很多种不同特异性的一抗，避免了标记很多一抗的需要，同时因为一抗结合不止一个二抗分子，所以二抗可以增强信号。所以一般情况下都釆用间接法进行检测。二、试验试剂与材料一试验试剂1、 丙烯酰胺和 N，N-亚甲双丙烯酰胺:应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有 29%(w/v)丙稀酰胺和 1%(w/v)N，N-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺 29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺 1g，加 H2O 至 100ml。)储于棕色瓶，4避光保存。严格核实 PH 不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可
9、以过滤。2、 十二烷基硫酸钠 SDS 溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O 去离子水配制，室温保存。3、 分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris 和 48ml1mol/LHCL 混合，加水稀释到 100ml 终体积。过滤后 4C 保存。4、 浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris 溶于 40mlH2O 中，用约 48ml 1mol/L HCL 调至 pH6.8 加水稀释到 100ml 终体积。过滤后 4C 保存。这两种缓冲液必须使用 Tris 碱制备，再用 HCL 调节 PH 值，而不用 T
10、ris.CL。5、 TEMED 原溶液四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑制。AP 提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数 ml，临用前配制.6. 10%过硫酸铵溶液 APS： 称取 1g 过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至 10ml，分装到 1.5ml 微量离心管中，冻存。7、 SDS-PAGE 加样缓冲液:在沸水终煮 3min 混匀后再上样，一般为 20-25ul，总蛋白量 100g。8、 Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g 甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至 1000ml，临用前稀释10 倍。PH8.39、
11、 转移缓冲液： 2.9g 甘氨酸、5.8gTris、0.37g SDS（可不加），200ml 甲醇（临用前加），加水至总量 1L。全湿法转膜缓冲液：Tris 3.0g，Gly 14.4g， M-OH 200ml，加去离子水至 1,000ml10、 丽春红染液储存液：丽春红 S 2g 三氯乙酸 30g 磺基水杨酸 30g 加水至 100ml 用时上述储存液稀释 10 倍即成丽春红 S 使用液。使用后应予以废弃。11、 脱脂奶粉封闭液 5%(w/v)取 1g 奶粉溶于 20ml 双蒸水或超纯水中。12、 NaN3 0.02% 叠氮钠(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。13、发光液1
12、3、显影液14、定影液二、试验仪器：PCR 仪、常温冰箱、低温冰箱、超低温冰箱、制冰机、离心机、电泳槽、恒压恒流电压器、摇床、半干法转膜仪、曝光盒三、实验方法：一配胶1 注意一定要将玻璃板洗净，最后用 ddH2O 冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。根据不同的目的蛋白配制不同的分离胶，混合均匀。2装好支架，安放好塑胶条和玻璃板，以免漏胶，可以提前检查安装是否漏胶。加入分离胶至顶部 2cm 左右。2 封胶：灌入 2/3 的分离胶后应立即封胶，胶浓度10%时可用 0.1%的 SDS封，浓度10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用 0.1%的 SDS。封胶后切记，勿动。待胶凝后将封胶
13、液倒掉，用滤纸将封胶液吸除，小心不要破损分离胶。 3灌好浓缩胶后 1h 拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡进入梳孔使梳孔变形。拨出梳子后用 ddH2O 冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的 SDS 封胶。若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min 后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。二样品处理1培养的细胞（定性）： 去培养液后用温的 PBS 冲洗 23 遍（冷的 PBS 有可能使细胞脱落）。 对于 6 孔板来说每孔加 200300l，6080的 1loadin
14、g buffer。 100，1min。 用细胞刮刮下细胞后在 EP 管中煮沸 10min，期间 vortex 23 次。 用干净的针尖挑丝，如有团块则将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，则可以将 EP 管置于 0后在 1400016000g 离心 2min，再次挑丝。若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可通过使用 1ml 注射器反复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。 待样品恢复到室温后上样。2培养的细胞（定量）： 去培养液后用温的 PBS 冲洗 23 遍（冷的 PBS 有可能使细胞脱落，若细胞脱落可全部吹打下来放入离心管内离心，去 PBS 上清后进行后续操作）。 6 孔板加入 150-200l
15、的冰预冷的 RIPA 裂解液后置于冰上 1020min。 用细胞刮刮下细胞，收集在 EP 管后震荡。 12000g 离心，4，2min。 取少量上清进行定量。 将所有蛋白样品用 RIPA 裂解液调至等浓度，充分混合后按照 1:4（根据buffer 的倍数决定）加 5loading buffer 后混匀，98，3min 蛋白变性，直接上样最好。剩余上样溶液可以低温储存，-70一个月，-20一周，4 12天。3组织： 匀浆 对于心肝脾肾等组织可每 50100mg 加 1ml 裂解液，肺 100200mg 加1ml 裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。 12000g 离心，4，2m
16、in。 取少量上清进行定量。 将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加 loading buffer 后直接上样最好，剩余溶液（溶于 1loading buffer）可以低温储存，-70一个月，-20一周，4 12 天，每次上样前 98，3min。三电泳1上样前将胶板下的气泡赶走。2用配好的上样蛋白品每孔上样 20l，样品两侧的泳道分别用 10l 或等体积的 1loading buffer 和 maker 上样，Marker 也用 1loading buffer 调整至与样品等体积。样品和 marker、buffer 等要加样放在胶的中间几个样孔，使其左右保持平衡。2初始电压为 80V 进行电泳，当样品电泳过浓缩胶和分离胶界限时改用电压120V,电泳 1 小时（时间根据电泳情况而定） 改为稳压电泳。3在目的蛋白泳动至距胶下缘 1cm 以上结束。四转膜1电泳结束前 20 分钟左右戴上手套开始准备
