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1、河北大学2009届本科生毕业论文（设计）粘细菌胞外多糖提取纯化及其生物活性检测装订线摘要随着这几年来糖化学的迅速发展，微生物胞外多糖的理论和应用也受到了人们的重视。胞外多糖的提取纯化和组分分析的实验技术都已成熟，为本实验提供了理论基础和实验指导。本文通过观察粘细菌在CAS固体培养基平板上的菌落黏性圈，从79株粘细菌中筛选到6株胞外多糖产量高的菌株，并对其中4株粘细菌产生的胞外多糖进行了提取纯化。粘细菌经液体发酵培养后，将发酵液进行乙醇沉淀得到粗多糖的提取物。粗多糖经氯仿、三氯乙酸脱蛋白，过氧化氢脱色，得到白色粉状纯化物。纯化的粘细菌胞外多糖采用0.5mol/L盐酸水解后，经高效液相色谱分析，可
2、确定菌株92033、93147、94016的胞外多糖中均含有葡萄糖、甘露糖，其他成分需进一步验证。4株粘细菌的胞外多糖纯化物的水溶液，经絮凝活性检测实验表明，均具有絮凝活性，其中菌株92033对4g/L的高岭土悬浊液的絮凝率达到92.84%，显示出良好的应用前景。关键词：糖化学胞外多糖粘细菌絮凝活性ABSTRACTAs the rapid development of sugar chemical over the past few years, the theory and application of the microbial exopolysaccharides were import
3、ant for the people. The extraction, purification and component analysis experimental technique of the exopolysaccharide had been mature, which provided a theoretical basis and experimental guidance. In this article, Myxobacteria which produced many polysaccharide were screened from the CAS solid med
4、ium by observing the stickiness of colony. We had got six strains which could produced high exopolysaccharide from the 79 strains, and four strains had been extracted and purificated. After liquid culture fermentation, we could obtained the crude polysaccharide extracts by alcohol precipitation meth
5、d from the fermentation broth. We obtained the white powder of the polysaccharide by the chloroform and trichloroacetic acid removing protein and hydrogen peroxide detreated. After purified Myxobacteria exopolysaccharides 0.5mol/L hydrochloride hydrolysis, we could determine that the strains of 9203
6、3,93147,94016 which containing glucose and mannose by high performance liquid chromatography analysis. Other components were proved by further validation. After the testing of the flocculating activity, the four myxobacteria aqueous solution of exopolysaccharide purification were all had flocculatio
7、n activity. Strains of the 92033 had an effct on 4g/L kaolin suspension and the flocculation rate rich to 92.84% and it showed a good application prospect.Key words:sugar chemicalexopolysaccharidesMyxobacteriaflocculation activity推进学校内涵建设深化年各项工作和“三乐两校”主题教育活动的开展，进一步繁荣校园文化，搭建具有时代特征大学生特点的文化艺术活动平台，促进学院间
8、师生的友谊目录一前言11.1粘细菌简介11.2微生物胞外多糖概况11.3微生物胞外多糖的应用21.3.1胞外多糖的药用性21.3.2胞外多糖的絮凝性21.4国内外研究现状31.5本实验的研究内容与意义3二本论42.1实验材料42.1.1菌种来源42.1.2实验所用培养基42.1.3主要仪器与试剂42.1.3.1仪器42.1.3.2试剂42.2实验方法52.2.1实验方案52.2.2粘细菌的发酵培养52.2.2.1菌种活化52.2.2.2产多糖菌株的筛选52.2.2.3产多糖菌株的种子液培养52.2.2.4种子液的发酵培养52.2.3粘细菌胞外多糖的粗提取62.2.4粘细菌胞外多糖的纯化62.2
9、.4.1初步纯化62.2.4.2胞外多糖蛋白质的去除72.2.4.3胞外多糖脱色72.2.5胞外多糖的组分分析72.2.5.1胞外多糖的完全水解72.2.5.2胞外多糖的高效液相色谱分析72.2.6胞外多糖的生物活性检测72.3结果与讨论82.3.1高产胞外多糖的粘细菌菌株的筛选82.3.2胞外多糖的提取物92.3.3胞外多糖的组分分析92.3.4胞外多糖的活性检测12三结论14谢辞15参考文献16河北大学2009届本科生毕业论文（设计）一前言1.1粘细菌简介粘细菌（Myxobacteria）是一类滑行运动，革兰氏染色阴性的单细胞细菌1。以二等分分裂繁殖2，严格好氧菌。最适生长温度在30左右。
10、在全世界都有分布，典型的生境是土壤3，近年来发现极端环境和海水中也有粘细菌的存在4。由于其复杂的多细胞行为，能够在细胞间进行信号的传递与感应来进行摄食和运动5，被认为是高等的原核生物。粘细菌根据其利用底物能力的不同，分为两个生理亚群：一类是可利用脂类、纤维素等多种大分子物质的溶纤维亚群，一类是以死的或活的细菌、真菌、藻类作为营养来源的溶菌亚群。但大多数粘细菌属于腐生菌，可在羊、兔等草食性动物的粪堆和腐烂树木里分离到粘细菌。粘细菌属于化能异养型的微生物，具有独特的生活史，分为两个阶段营养细胞生长期和细胞发育期。当营养细胞发育到一定阶段，或处于饥饿等不利环境的条件下，可能通过信号传递细胞开始聚集，
11、在固体表面形成由细胞和粘液组成的，颜色鲜艳，肉眼可见的子实体，如图1-1。粘细菌种类不同，其子实体的形态也有所不同。有的形成松散的球块状，有的为一定形状的复杂形体。在子实体内形成粘孢子，对干燥，热，紫外线等具有较强的抗逆性，也可称为休眠体，是理想的保存材料6，所以遇到适宜的环境又开始萌发为营养细胞。图1-1粘细菌子实体1.2微生物胞外多糖概况微生物多糖是指大部分细菌，少量真菌和藻类产生的多糖。分泌到细胞外的多糖，包括革兰氏阴性菌细胞膜外的多糖成分以及革兰氏阳性菌的肽聚糖7，称为胞外多糖，简称为EPS。目前已工业化的胞外多糖主要有以下几个8 黄原胶黄原胶,是由黄单胞菌属产生的一种阴离子型多糖生物
12、聚合物。早在上个世纪50年代Jeanes就展开了黄原胶产生菌的筛选工作。由于黄原胶具有广泛的性能，如：增稠性、水溶性、悬浮性，所以黄原胶成为工业化的主要胞外多糖，而我国在80年代才开始小批量的生产。 硬葡聚糖硬葡聚糖，由真菌小核菌发酵产生的聚合物。具有很强的增稠、抗温、抗剪切的能力，主要性能优于黄原胶。 结冷胶结冷胶，是由在有氧条件下，沼假单胞菌生产的一种线性阴离子杂多糖。1978年被发现,后投入批量生产。具有高粘性和高热稳定性，可形成类似琼脂的热可逆性凝胶，这一特性使其成为生物培养基的替代品。1.3微生物胞外多糖的应用多糖除对菌体本身具有重要的生物学意义，具有多效性、低毒性、来源广泛、天然绿色等优点。与现有药物的联合应用，除了可提高药物的作用范围和效力，还可推迟或防止耐药性的产生。另外，已报道过多糖可作为微生物絮凝剂的主要活性成分9。胞外多糖的这些优点吸引了研究者的注意力。1.3.1胞外多糖的药用性多糖的抗肿瘤活性多糖的抗肿瘤活性是通过诱导免疫细胞因子和其受体基因的表达来增强机体的免疫力10。有些微生物来源的多糖与肿瘤细胞表面的糖类分子很相似，能抑制肿瘤细胞的粘附，从而抑制了肿瘤细胞的侵袭与转移。多糖的这一特性曾有报道：一株乳酸菌产生的胞外多糖可增强小鼠的抗肿瘤作用11。就多糖的抗肿瘤的作用而言，可将其分为两类，一是通过毒性直接杀死肿瘤细胞；二是增强机体的免疫能力间接杀死肿瘤细
