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1、,多色流式检测的抗体组合设计,流式细胞仪的基本结构,流路： 流动室 鞘液 sheath 样本流 sample 光路： 光源 光学收集系统 电路： 光电倍增管(PMT)、光电二极管、 放大器（线性、对数） A/D 转换（光信号转换为电信号之后的处理分析 道数和电信号的脉冲转换 ） 统计：计算机 细胞分选系统 （分选器：喷嘴，稳定液流，充电电路）,流 路,流动室,侧向及荧光信号,前向散射光信号,鞘液,激光,样品管、鞘液管和流动室等,由于鞘液的作用，待测细胞被限制在液流的轴线上流体动力学聚焦,流式细胞仪的光源和光路,光 源 采用激光光源 是一种相干光源，它能提供单一波长、单一方向、同步的稳定光照,光
2、斑直径d可由下式确定：d=4f/D。为激光波长；f为透镜焦距；D为激光束直径。,激光源,垂直透镜（约束激光的宽度）,横向透镜（约束激光的高度）,形成小的椭圆形激光束,流动室,激光光路,检测信号,散射光测量原理,波长与入射光一致，为细胞固有的物理及生理特性，可依此对未染色的细胞进行分析,散射光的性质,FS(Forward Scatter)信号,固有信号：细胞相对大小,SS(Side Scatter)信号,固有信号：细胞相对复杂内部结构，粒度,散射光的性质,荧光信号检测原理,每种荧光染料均有特定的激发波长, 并激发后会有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长. 利用各种不同波长的光学滤片来
3、收集(检测)这些光学信号,ATOM,荧光素及荧光发生机理简介,FITC荧光素的激发和发射光谱,荧光素的使用： 选择正确的激光器；确定正确的滤光片； 确定所需荧光探测器（PMT）,FITC,流式常用荧光染料,Epics XL FC500（488nm）,荧光信号,双色直接染色,CD3-FITC,CD19-PE,不同的荧光素标记不同的细胞抗原。 不同的荧光素在受到激发光激发后发射出不同波长的荧光。 根据荧光波长可区分出不同细胞抗原。 根据荧光信号的强弱可反映细胞抗原的表达含量。,荧光信号,光学系统：滤光片（Filter）,荧光激发波长根据所选的荧光素而异，可通过一组不同的光学滤片传递到各个PMT(光
4、电倍增管中),XL流式细胞仪光路图,Air-cooled Argon Ion Laser,Beam Shaping Lenses,High Sensitivity Quartz Flow Cell,Forward Scatter Detector,Side Scatter Detector,525BP FL1 (FITC),575BP FL2 (PE),620BP FL3 (ECD),675BP FL4 (PC5),488DL,488BK,550DL,600DL,645DL,FC500流式细胞仪光路图,488 DL,488 BK,550 DL,525 BP,600 DL,575 BP,640
5、DL,620 BP,675 BP,流式细胞仪的电路,进行信号检测和分析 荧光信号由光电接收器（PMT）接收，转变为电信号，可分析电压脉冲的高度、面积和宽度 电脉冲信号经A/D转换成数字信号 数字信号传送到计算机，进行储存、 作图、 统计分析,电脉冲信号的产生及光电管和检测系统,光电管和检测系统：放大器,基本原则 - 信号强弱差10倍or需分析弱荧光:使用对数放大器(如荧光),检测的一般步骤,设置检测方案（PROTOCOL) 染色标本（同型对照，补偿管，待测样本） 同型对照管调电压 电压不变，补偿管调补偿 电压不变，补偿不变，上检测管检测后直接阅读结果,电压调节利用同型对照：设置背景,电压 vo
6、lts 增益 Gain,设定阴性和阳性信号强度的临界点,荧光补偿,FITC,PE,受激光照射后FITC和PE分子发射光谱相互干扰,荧光补偿的调节,补偿调节利用单标样本，来消除荧光交叉,原则： 单管单色标记交叉调节,确认电压,单标记管自动计算CROSSOVER,验证管,补偿调节-最精确的全矩阵软件,利用软件进行全矩阵颜色补偿（任何两个荧光检测通道之间都可以进行补偿）,数据分析,Dot Plot（双参数点图） Histogram（单参数直方图） Region（门） Statistics（统计结果）,参数,影响一个成功的多色实验的因素：,高灵敏，高分辨率的仪器,数据分析准确可信（Kaluza）,多色
7、抗体组合方案设计,高质量的荧光抗体,405nm,638nm,488nm,Gallios/ Navios 流式细胞仪,Gallios滤光片组合,影响检测灵敏度的因素,检测限制,抗原在细胞上的 分布情况,染料荧光强度 荧光光谱, 空间位阻 非特异结合 制备滴定 ,FITC,PE,ECD,PC5.5,PC7,APC,APC-A700,APC-A750,PacBlue,KrO,多种荧光素为多色分析提供了可能,不同公司的荧光染料强度比较,(Brightest on channel),Krome Orange,荧光素的荧光强度,CD8 conjugates,FITC,PE,ECD,PC5,PECy5.5,
8、PC7,APC,(various) Alexa 700,Pacific Blue,488nm (blue),638nm (red),405nm (violet),(LT) Pacific Orange,(BD)APC-H7,APCAlexa 750,APCAlexa 700,SN 值（signal/noise）,BC 荧光染料 染色指数,Source: Dartlab; http:/www.dartmouth.ed,SN信噪比: MFI(pos) / MFI(neg), 420.15/0.37 = 1136,SI染色指数: (MFI(pos)-MFI(neg)/2*SD(neg), (420.
9、15-0.37)/2*0.23 = 913 最大程度反映了对于同一荧光染料的不同仪器的性能,BC 荧光染料 染色指数,荧光素的特性 Crosstalk（串色）,Crosstalk Index（串色指数）: SN(MFI(secondary channel) / SN(MFI(primary channel) * 100,CI: 2.71 / 1278.24 = 0.21,CI: 69.46 / 1278.24 = 5.43,CI: 578.48 / 1278.24 = 45.26,CI: 108.29 / 1278.24 = 8.47,(0.84/0.31)/(421.82/0.33),串色指
10、数由荧光染料本身的特性决定,Crosstalk Index: SN(MFI(secondary channel) / SN(MFI(primary channel) * 100,荧光素的特性 Crosstalk(串色指数),CI: 2.71 / 1278.24 = 0.21 CF: 0.1,CI: 69.46 / 1278.24 = 5.43 CF: 5.97,CI: 578.48 / 1278.24 = 45.26 CF: 31.28,CI: 108.29 / 1278.24 = 8.47 CF: 5.97,CF: Compensation Factor CFCI,荧光素特性 - Cross
11、talk,Crosstalk Index: SN(MFI(secondary channel) / SN(MFI(primary channel) * 100,弥散程度大,CI: 2.71 / 1278.24 = 0.21 CF: 0.1,CI: 69.46 / 1278.24 = 5.43 CF: 5.97,CI: 578.48 / 1278.24 = 45.26 CF: 31.28,CI: 108.29 / 1278.24 = 8.47 CF: 5.97,数字化荧光补偿,通过logicle 进行线性补救 (在低对数通道进行线性压缩),未补偿: SD CV = MFI SD(pos) SD(
12、neg) MFI(pos) MFI (neg),FL3,FL3,FL3,FL3,部分补偿: SD CV = MFI SD(pos) SD(neg) MFI(pos) MFI (neg),FL3,FL3,FL3 median(PEpos) = FL3 median (PEneg),正确补偿后: SD CV = MFI SD(pos) SD(neg) MFI(pos) = MFI (neg),34%,46%,62%,对于既定的荧光素，它有固定的发射波长，荧光补偿数值只反映相对的PMT的电压.,荧光补偿,405nm,638nm,488nm,“激光内” 荧光补偿,488nm,荧光补偿,405nm,63
13、8nm,488nm,488nm,荧光补偿,“激光间” 荧光补偿,Its just numbers !,荧光补偿,10 色 distortion 图谱 (Gallios, Navios),Distortion 矩阵,S I L E N T,U N T O U C H A B L E,Untouchable = 其他染料没有干扰 (clean row),Silent = 不会漏进其他通道 (clean column),Distortion 矩阵,U N T O U C H A B L E,U N T O U C H A B L E,S I L E N T,U N T O U C H A B L E
14、,Distortion 矩阵,Untouchable = 其他染料没有干扰 (clean row),Silent = 不会漏进其他通道 (clean column),U N T O U C H A B L E,U N T O U C H A B L E,U N T O U C H A B L E,S I L E N T,S I L E N T,S I L E N T,Distortion 矩阵,Untouchable = 其他染料没有干扰 (clean row),Silent = 不会漏进其他通道 (clean column),抗原间的关系 互相排斥,互相排斥的标志可以为对方提供dump 通道
15、,抗原间的关系 共表达,ECD+/PC5.5+的细胞群在 PC7 通道内 阴阳性界限向右移,共表达能够影响overspill 通道阴性群的分布,CD27-PC7,（Logicle view）,(Logarithmic view),抗原间的关系 亲代和子代,是共表达和相互排斥的结合体 这里的排斥是单向的，也可解释为没有共表达,compensated,uncompensated,正确地确定子代和亲代的位置能够确保更好的结果。,抗原间的关系 亲代和子代,抗原分布 分群明显 vs 连续表达,B cells,Activated T8 cells,达到最佳抗体组合的6大法则, 弱表达抗原选择强荧光染料，强表达抗原选择弱荧光染料(“老法则”) 细胞内抗原（有空间位阻）检测优先选择小分子荧光素 多色检测时弱表达抗原放在被干扰较小（untouchable）的检测通道，强表达抗原放在对其他通道干扰较小（silenc
